新型人類化 CYP21A2-I173N 小鼠模型重現人類先天性腎上腺增生症的表型特徵（A Novel Humanized CYP21A2-I173N Mouse Model for Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Mimics Phenotypic Features of Human CAH Patients）
- 會議／場次： ENDO 2026／Adrenal: Back to the Basics（ORF13）
- 短講： ORF13-07
- 講者： Angela Huebner
整理稿
為何需要更實用的 21-hydroxylase deficiency 動物模型
先天性腎上腺增生症（congenital adrenal hyperplasia, CAH）是一組由腎上腺類固醇生成缺陷造成的罕見遺傳疾病，其中約 90%–95% 為 21-hydroxylase deficiency（21-OHD）；投影片所列的發生率約為每 15,000 名活產兒 1 例。21-OHD 會造成 glucocorticoid 與 mineralocorticoid 缺乏，並使腎上腺 androgen 大量增加。女性新生兒可能出現外生殖器男性化；疾病控制不佳的女性日後也可能持續出現男性化表現。
21-OHD 是由 CYP21A2 變異造成的體染色體隱性疾病。為壓制 androgen 過量，臨床上往往需要超生理劑量 glucocorticoid，因而伴隨生長不良、肥胖、高血壓與骨質疏鬆等代價，也促使新療法持續發展。問題在於，領域內一直缺乏適合藥物前臨床測試的有效體內模型。早期的 Cyp21a1 knockout 小鼠必須接受大量且持續的 dexamethasone 才能存活，飼養與實驗操作都十分困難。
Slides 延伸補充：投影片以殘餘酵素活性與臨床嚴重度的連續光譜呈現常見變異；I173N 與 R484Q 位於約 1% 殘餘活性的區段。這張圖用來說明選擇兩個變異建立模型的理由，不代表每位患者的基因型都能完全預測表型。
人類化 I173N 與 R484Q knock-in 小鼠的建立
研究團隊選擇在人類患者中常見、約保留 1%–2% 酵素活性的 I173N 與 R484Q，建立兩款 knock-in 小鼠。I173N 在人類多表現為單純男性化型，部分患者則可呈失鹽型；R484Q 通常與單純男性化型相關。本次報告聚焦純合子 I173N 小鼠，R484Q 模型則已由團隊另行發表。
建模時先以人類 CYP21A2 取代小鼠 Cyp21a1，再利用 CRISPR–Cas9、鄰近目標位點的 single-guide RNA 與帶有 p.I173N 或 p.R484Q 序列的 repair oligo 導入變異。初次繁殖時，團隊完全得不到存活的 I173N 純合子後代，因此自胚胎第 19 天左右開始，透過飲水給懷孕母鼠 dexamethasone，持續至幼鼠出生後第 21 天斷奶。斷奶停藥後，幼鼠不再接受 glucocorticoid 補充，仍能長期存活。
Slides 延伸補充：投影片顯示 dexamethasone 的遞減方案為 E19 起 2 µg/day、D07 起 1 µg/day、D14 起 0.2 µg/day，至 D21 停藥；資料收集窗口標示為 19–22 週。講者口述則將本次呈現樣本概括為約 19–20 週齡，兩者應理解為同一成年小鼠取樣期的近似說法。
體重、腎上腺增生與人類影像的相似性
I173N 純合子雌鼠的體重略低於 wild-type（WT）雌鼠，雄鼠體重則未見同樣差異；相反地，雌雄純合子小鼠的腎上腺重量都明顯增加。投影片顯示每組 n≥7，雌鼠體重差異為 p≤0.01，兩性腎上腺重量差異皆為 p≤0.001。
肉眼與組織切片都可見純合子小鼠腎上腺顯著腫大，並呈現符合 CAH 的 adrenocortical hyperplasia。講者也並列健康新生兒與 CAH 新生兒的腎上腺超音波，指出人類 CAH 新生兒的腎上腺增生外觀與模型所見具有相似性。這是形態上的對照，不等同於證明小鼠已重現人類疾病的全部生理機制。
腎上腺基因表現、類固醇圖譜與 ACTH 驅動
腎上腺基因表現分析顯示，純合子小鼠具有強烈的人類 CYP21A2 表現，Cyp11a1、Cyp11b1 與 Cyp11b2 也整體增加。講者對 Cyp11b2 的升高尤其感到意外，推測可能反映高 ACTH 對腎上腺皮質的廣泛刺激。腦下垂體 Pomc 亦上升，支持 HPA axis 驅動增強的解釋。
Slides 延伸補充：以 Actb 正規化、每組 n≥7 的圖表中，CYP21A2 與多個 steroidogenic enzyme 訊號在一個或兩個性別達顯著差異。Pomc 在雌鼠達顯著升高（圖示 p≤0.01），雄鼠則為上升趨勢但未達顯著（p=0.0712）；因此不能把 p=0.0712 誤歸到雌鼠。
血漿 steroid profiling 顯示，純合子小鼠的 11-deoxycorticosterone 與 corticosterone 很低，progesterone 明顯升高；血漿 ACTH 也增加。這組「低下游類固醇、高前驅物、高 ACTH」的方向與人類 21-OHD 的核心內分泌異常一致。投影片中的 steroid 以 LC–MS/MS 測量，11-deoxycorticosterone、corticosterone 與 progesterone 均以 ng/mL 表示；ACTH 圖則以 pg/mL 表示。
尿液 catecholamine 代謝物、血壓與 aldosterone
尿液分析顯示，normetanephrine 與 metanephrine 只在雌性純合子小鼠下降，3-methoxytyramine 則在雌雄兩性都下降；各結果以 nmol/mmol creatinine 表示。講者認為，這可能指向 adrenal medulla 功能低下，而類似現象在人類 CAH 也曾被描述。不過，這仍是由代謝物變化提出的解釋，性別差異與確切機制都需要進一步研究。
I173N 純合子小鼠的收縮壓與舒張壓在兩性都顯著降低。相對地，雄鼠 plasma aldosterone 與 WT 相近，雌鼠反而顯著升高；原圖標示雌鼠差異為 p≤0.0001。目前無法判定低血壓主要來自 adrenal medulla 功能降低，或極低 corticosterone，aldosterone 結果也顯示不能用單一簡化機制解釋。
性腺表型與明顯的性別二態性
雌性純合子小鼠不孕，動情週期停留在 diestrus。卵巢切片缺乏 corpora lutea，並顯示 follicular development 受損，符合 ovulatory failure。投影片中的星號標示的是 pre-antral follicles（竇前濾泡），不是統計顯著性符號。
雄性純合子小鼠則仍具生殖能力；無論肉眼或組織學，睪丸與 WT 並無明顯差異。雌雄結果的落差，連同 catecholamine 代謝物與 aldosterone 的性別差異，構成這個 I173N 模型值得後續釐清的 sexual dimorphism。
腎上腺 transcriptomics 的探索性訊號
團隊針對雌性 I173N 純合子與 WT 小鼠的腎上腺進行 bulk RNA sequencing。講者將結果概括為 steroidogenic 與 ACTH-response pathways 上調，部分 circadian、developmental 與 metabolic pathways 下調，可能反映腎上腺過度活化，以及正常發育與節律受到干擾。
Slides 延伸補充：Gene Ontology 圖同時呈現正、負方向的多個 pathway，且個別項目的方向與講者口頭總結需要放在整體 enrichment 分析中解讀。這份短講未提供獨立驗證或因果實驗，因此較穩妥的結論是「提示可能的過度活化與節律／發育異常」，而非宣稱已證實特定 pathway 機制。
前臨床用途、可量測指標與研究結論
講者認為，人類化 21-OHD knock-in 小鼠可成為測試 CAH 新療法的體內平台，候選方向包括 chaperones、peptidomimetics 或 small molecules，以及 stem-cell treatment。這是模型的潛在應用範圍；本次報告本身並未呈現上述療法的介入成效。
團隊將 CYP21A2-p.I173N 與 CYP21A2-p.R484Q 描述為首批可存活、可部分重現人類 CAH 表型的 knock-in 小鼠。I173N 的表型比近期發表的 R484Q 模型更強。講者並提出循環中的 progesterone、11-deoxycorticosterone、corticosterone，以及尿液 tetrahydroprogesterone，可作為未來療效研究的候選 readouts。模型同時顯示多項腎上腺與性腺的性別二態性，仍待進一步驗證。
這些模型的價值在於提供可操作的轉譯研究平台，但目前證據主要是單一成年取樣期的表型鑑定；能否預測人類療效、安全性與長期病程，仍須透過實際介入研究確認。
現場問答
是否存在 21-deoxyaldosterone 的替代轉換途徑？
第一位與會者注意到模型中的 aldosterone 並未如預期降低，提到二十多年前曾有研究認為 21-deoxyaldosterone 可在周邊組織由另一種 cytochrome 轉成 aldosterone；他不記得確切酵素，也說自己研究室曾在 lymphocytes 觀察到類似現象，但該研究沒有完成發表。他另舉 Maria New 過去報告的一位 classic 21-hydroxylase deficiency 患者為例：患者一度停藥失聯超過一年，回診時狀況尚可且 aldosterone 正常，當時亦曾以替代轉換途徑解釋。
Angela Huebner 回應，團隊在另一款小鼠也觀察到 aldosterone 升高，原先便懷疑腎上腺內有某種補償機制；她會回頭查閱與會者提到的舊文獻。由於與會者沒有提供確切 cytochrome 或正式文獻，本次整理不進一步推定酵素身分，也不把這項口頭經驗視為已證實的機制。
為何產前需要 dexamethasone，而人類胎兒不會如此死亡？
第二位與會者詢問，為何必須治療懷孕母鼠才能得到存活的純合子後代，以及為何人類帶有相同類型變異時通常不會出現胎兒期死亡。Angela Huebner 表示，起點是實驗觀察：未治療時完全得不到純合子幼鼠，因此推測牠們在子宮內或圍產期死亡。團隊借鑑其他疾病模型，治療母鼠以間接支持胎鼠發育；產前至斷奶期間使用 dexamethasone 後，確實得到了可存活後代，而且 D20–D21 停藥後仍能在沒有補充治療下存活。
至於 dexamethasone 如何改善存活，以及小鼠與人類為何有這種物種差異，講者明確表示目前無法回答。這項未解機制是模型的重要限制，不能僅憑救援成功就推論其圍產期病理與人類 CAH 完全相同。