AR 凝聚體如何重塑治療抗性前列腺癌（How AR Condensates Rewire Therapy-Resistant Prostate Cancer）
- 會議／場次： ENDO 2026／The Order & Disorder of Nuclear Receptors（SY23）
- 短講： How AR Condensates Rewire Therapy-Resistant Prostate Cancer（SY23-01）
- 講者： Nada Lallous, PhD
整理稿
從 AR 訊號、治療抗性到生物分子凝聚體
本場由 Doug Kojetin 與 Kendall Nettles 共同主持。Nada Lallous 首先說明，她的實驗室位於 Musqueam、Squamish 與 Tsleil-Waututh Nations 的傳統未讓與領地，並表達感謝。她接著把問題聚焦在雄性素受體（androgen receptor, AR）凝聚體（condensates）於治療抗性前列腺癌中的角色，也就是去勢抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）。
Slides 延伸補充：題名投影片標示 Nada Lallous 為 University of British Columbia Assistant Professor、Vancouver Prostate Centre Senior Research Scientist，以及 Gobind Khorana Protein Engineering Core 主持人。
AR 訊號是前列腺癌進展的重要驅動因子，也是治療的主要標的。未受刺激時，AR 通常位於細胞質並與分子伴侶蛋白（chaperone proteins）結合；雄性素結合後，AR 發生構形改變、進入細胞核並調控標的基因。臨床治療因此會降低雄性素濃度，或阻斷雄性素與 AR 結合，但腫瘤仍可能透過多種機制形成抗性，包括 AR 或共活化因子過度表現、配體結合域（ligand-binding domain, LBD）突變使拮抗劑轉為致活劑，以及表現缺失 LBD、呈持續活化的 AR 剪接變異體。
生物分子凝聚體是細胞內會依刺激或功能需求形成、之後又可解離的液滴狀結構，參與壓力反應、DNA 修復、蛋白質轉譯與轉錄。Lallous 引用 Tanja Mittag 實驗室提出的「連續體」概念：轉錄因子的運作可由可溶性複合物延伸至凝聚體。傳統模式是轉錄因子辨識特定 DNA，招募共因子與 RNA polymerase II；若某個基因座具有多個結合位點，或局部轉錄因子濃度很高，則可能形成凝聚體，進一步聚集轉錄機器並增強一部分標的基因的表現。
全長 AR 凝聚體的動態與液態特性
Lallous 在 2020 年成立實驗室時，原本希望用共因子穩定 AR 高度無序的 N 端結構域（N-terminal domain, NTD），再以 cryo-EM 解析完整結構，但未能成功。隨著相分離研究發展，她注意到含大片固有無序區域（intrinsically disordered regions, IDRs）的轉錄因子容易形成凝聚體，因而轉向研究前列腺癌細胞內的 AR 凝聚現象。
團隊先前已在 LNCaP 細胞中顯示：非二聚化 GFP 標記的全長 AR（AR-FL）在雄性素刺激後進入細胞核並形成斑點；移除雄性素時焦點減少，再加入雄性素又會恢復。凝聚體的形成與 AR 轉錄活性及特定 DNA 序列結合相關。團隊也以重組 AR-FL 在體外重建液滴，並觀察到液滴彼此融合、形成較大凝聚體，支持其液態樣物理性質。
AR-V7 在 CRPC 模型中可自主形成凝聚體
團隊接著以保留 NTD、但缺失 LBD 的 AR-V7 為模型。早期在不表現剪接變異體的 LNCaP 細胞中，只要刪除 AR-FL 任一結構域，包括模擬 AR-V7 的 LBD 缺失，凝聚體形成就會消失。然而，博士後研究員 Shabnam Massah 觀察內源性 AR-V7 時發現，在表現剪接變異體的 CRPC 模型中，AR-V7 無論有無雄性素都可形成凝聚體；同一批細胞內的 AR-FL 則仍需雄性素，才會形成顯著數量的凝聚體。
外源性實驗也得到一致結果：在非 CRPC 的 LNCaP 中，AR-V7 只形成很少凝聚體；在所有受測 CRPC 模型中，則不依賴雄性素即可形成凝聚體。為確認 AR-V7 是否需要 AR-FL，團隊用辨識 LBD 的 PROTAC 降解 AR-FL。Western blot 顯示 AR-FL 被降解而 AR-V7 不受影響；AR-FL 焦點隨之消失，但 AR-V7 焦點數量未變。這表示在受測 CRPC 模型中，AR-V7 凝聚體形成不依賴雄性素，也不依賴 AR-FL 的存在。
飽和濃度、DNA 親和力與序列選擇
團隊先在 AR 陰性的 PC3 細胞中表現漸增濃度的 AR-FL-GFP 或 AR-V7-GFP，量化蛋白濃度與焦點密度。AR-V7 要達到與 AR-FL 相同的凝聚體密度，所需濃度至少高 2 倍；重組蛋白的體外實驗則顯示，AR-V7 的相分離濃度門檻約高 2 至 3 倍。
初步的單分子 C-Trap optical-tweezers 實驗以兩顆微珠拉直含 androgen response element（ARE）的 DNA，並以紅色螢光標示 ARE 所在區域。AR-FL 可在低濃度下定位至該位置；要取得相近的 AR-V7 結合訊號，需使用 5 倍濃度。DNA 移出蛋白通道後，AR-FL 仍維持結合，AR-V7 則迅速解離。講者特別指出，這些仍是初步資料，而且是在非凝聚體情境下進行，因此只能支持 AR-V7 與 AR-FL 的 DNA 結合性質不同，尚不能直接等同於細胞內凝聚體的行為。
團隊再測試 DNA 是否會在 AR-V7 凝聚體中選擇性富集。Scrambled DNA 沒有明顯進入液滴；含特定 ARE 的 DNA 則形成明亮紅色焦點，加入相同但未標記的 DNA 可將其競爭置換。特定 DNA 也能降低 AR-V7 形成液滴所需的門檻濃度。
比較 AR half-site、canonical palindromic ARE 與在 CRPC 患者基因組較常見的 chimeric FOXA1-ARE 後，後者在 AR-V7 與 AR-FL 液滴中都最明顯富集，也最能降低 AR-V7 的凝聚門檻。競爭置換實驗同樣顯示，chimeric FOXA1-ARE 的置換能力最強。這些結果指出序列選擇可能參與凝聚體形成，但其來源究竟是蛋白本身的結合親和力，或凝聚體環境特有的富集效應，仍需直接結合實驗釐清。
以 5Y2S 突變株拆解凝聚體依賴型轉錄
為測試 AR-V7 凝聚體是否對特定轉錄程式具有功能性貢獻，團隊參考 Xavier Salvatella 實驗室的工作，把 NTD 內 tyrosine（Y）改為 serine（S）。較多突變會連帶影響核轉位，因此團隊尋找能破壞凝聚、又盡量保留其他功能的最小組合，最後得到 5Y2S 突變株。講者呈現的細胞定位、蛋白表現與 ChIP-PCR 結果顯示，5Y2S 明顯降低凝聚體形成，但在這些檢測中沒有明顯改變 AR-V7 的表現、核內量或 DNA 結合。
團隊將 wild-type AR-V7、5Y2S 或 GFP 對照轉入 AR 陰性的 PC3 細胞，利用 bulk RNA sequencing 區分「凝聚體依賴型」與「凝聚體非依賴型」基因。凝聚體依賴型基因的富集路徑包括 KRAS signaling、hypoxia 與 Notch signaling。在 GFP 對照中這些基因沒有相同表現，wild-type AR-V7 會提升其表現，5Y2S 則使表現下降；被歸類為凝聚體非依賴型的基因未呈現相同變化。
因為上述結果主要來自 PC3，團隊也在內源性表現 AR-V7 的 22Rv1 與 LNCaP95 模型中驗證。在不能以外源突變株直接取代內源蛋白的情況下，他們改用 1,6-hexanediol 干擾凝聚體。講者強調此化學物具有毒性，團隊先找出未觀察到細胞毒性的條件；在該條件下，凝聚體減少，凝聚體依賴型基因表現也下降，而凝聚體非依賴型基因較不受影響。這類化學干擾仍可能具有非特異作用，因此結果應與突變株及後續機制實驗合併解讀。
轉錄動力學、啟動子結構與細胞表型
隨 wild-type AR-V7 濃度增加，凝聚體依賴型基因表現呈指數型上升，5Y2S 會破壞這種陡升；相對地，凝聚體非依賴型 AR-V7 標的基因呈線性增加，wild type 與突變株之間沒有顯著差異。團隊因此與 Nathan Lack 實驗室合作分析基因組特徵，發現凝聚體依賴型基因的 promoter 區域傾向含較多 androgen receptor binding sites（ARBSs）。體外設計不同 ARBS 數量的 DNA 後，ARBS 越多，DNA 越傾向富集於 AR-V7 與 AR-FL 凝聚體。
以 5Y2S 破壞凝聚體時，受測細胞的增殖與遷移都下降。這些實驗支持凝聚體狀態對部分 AR-V7 轉錄及細胞表型具有功能性貢獻，但尚不足以把所有 CRPC 惡性行為歸因於凝聚體，亦不能排除突變或化學干擾的其他效應。
患者相關性與研究限制
團隊正在分析中心內的 tissue microarrays（TMA）。初步資料顯示，癌組織區域中出現細胞核 AR speckling 的細胞比例，傾向高於相鄰良性組織；講者沒有把這項早期觀察描述為已完成的臨床驗證。
由於不同研究對 AR-V7 標的基因並無一致清單，團隊整合三項比較 androgen-dependent 與 androgen-independent 模型的研究，再與自身凝聚體依賴型基因取交集，建立較精煉的候選 signature。此 signature 在 CRPC 患者中高於 adenocarcinoma 患者；signature 高表現者也傾向具有較高的 proliferation 與 metastasis scores。這些都是初步、以資料庫交集為基礎的關聯，仍需在不同 cohort 驗證，並縮小到可用 multiplex IHC 檢測的範圍；不能據此推論凝聚體已被證實會造成人體腫瘤轉移。
結論與未來方向
本研究顯示，AR-V7 可在受測 CRPC 模型形成凝聚體；5Y2S 提供一個干擾凝聚體、探討其轉錄功能的實驗工具。資料也支持 AR-V7 同時啟動凝聚體依賴型與非依賴型轉錄程式，前者較多連結至生長與增殖相關路徑。
下一步包括用 proteomics 比較凝聚體相與可溶相的組成，並研究小分子在凝聚體內外的分配。講者提出一項待驗證假說：若某些化學物不能有效進入凝聚體並接觸標的，可能形成另一層治療抗性。這目前是藥物篩選與機制研究方向，並非已證實的臨床抗藥機制。
現場問答
Y534 phosphorylation 是否足以破壞凝聚體？
聽眾詢問是否已專一測試 Y534 phosphorylation，以及單一位點改變是否足以影響凝聚體。Lallous 回答，論文審查者也注意到 4Y2S 與 5Y2S 的差異，團隊目前正在製作單一突變並測試，尚無答案。
核內 AR 的分配比例與 phase curve
另一位聽眾詢問是否量測過核內 AR 的 partition percentage，並評估高濃度時是否進入 one-phase regime。Lallous 表示尚未進行這些測定，現有影像解析度也是限制；要回答此問題可能需要 super-resolution microscopy。
雄性素或其他疏水性分子會不會進入凝聚體？
David Moore 詢問 AR-V7 凝聚體是否會擷取疏水性的雄性素或其他分子。Lallous 表示，體外加入未標記 androgen 時沒有觀察到凝聚體行為改變；要知道分子是否實際分配至凝聚體，仍需用可追蹤的標記分子，團隊尚未測試。
DNA 序列選擇與 poly-Q construct
Steve Kregel 對純化系統中的 DNA 序列選擇提出疑問。Lallous 說明，團隊也對結果感到意外，因此進行多項競爭實驗；目前只有 chimeric FOXA1-ARE 顯示最佳親和／富集表現，palindromic ARE 優於 half-site。下一步將在非凝聚體狀態直接量測 AR-V7 與 AR-FL 對各序列的結合，以區分蛋白本身親和力與凝聚體富集效應。至於純化所用 poly-Q tract，講者僅確認是 canonical AR sequence，並未在回答中給出一個經實驗核對的精確重複數。
為何 LNCaP 與 LNCaP95 的結果不同？
Scott Dehm 詢問 LNCaP 缺少或多出什麼因子，使外源 AR-V7 不能像 LNCaP95 一樣形成凝聚體。Lallous 指出，兩者表現相同量的 AR-V7 時仍有不同結果，因此不是單純的蛋白表現量問題。她提出兩項尚待驗證的可能：CRPC 細胞的某些 enhancer 變得開放，使局部 AR 濃度升高；或 kinase／phosphorylation 狀態不同。團隊正以不同細胞 lysate 形成、沉澱凝聚體，再以 proteomics 比較組成。
已有凝聚體時，非凝聚體轉錄如何發生？
線上問題詢問凝聚體形成後，凝聚體非依賴型轉錄如何同時存在。Lallous 的模型是：ARBS 數量較少的基因組區域只招募有限 AR，局部濃度未達相分離門檻，因此以可溶性複合物完成線性轉錄；在具有多個密集結合位點、可能包括 super-enhancers 的區域，局部 AR 濃度達到門檻後才形成凝聚體並啟動凝聚體依賴型轉錄。