Transcription Regulation by Stress-induced Nuclear Biomolecular Condensates

會議／場次： ENDO 2026；SY23 — The Order & Disorder of Nuclear Receptors
短講： SY23-03 — Transcription Regulation by Stress-induced Nuclear Biomolecular Condensates
講者： Sethu Pitchiaya, PhD

整理稿

演講引言與研究背景：細胞如何回應壓力

演講者 Sethu Pitchiaya 博士首先感謝會議組織者的邀請，並幽默地回應主持人 Doug Kojetin 博士的開場。他表示自己雖然不直接研究核受體（nuclear receptors）或核激素受體（nuclear hormone receptors），但他的研究核心聚焦於核凝集體（nuclear condensates）以及其中的無序結構（disorder），這些結構對細胞恆定性（cellular homeostasis）、核受體生物學以及激素驅動型癌症（hormone-driven cancers）發揮著關鍵調節作用。

演講者實驗室的核心興趣是瞭解細胞如何應對壓力（stress）。這裡的「細胞」涵蓋了各種組織語境下的哺乳動物細胞，而「壓力」則泛指任何將細胞推離恆定狀態（homeostasis）的干擾（perturbation）。當細胞面臨壓力時，通常會做出根本性的命運決策：選擇死亡、生存或蓬勃生長（thrive）。

這些決策在生理與病理語境中具有重要意義：

退化性疾病（Degenerative diseases）： 細胞在壓力下過度頻繁地死亡，是此類疾病的典型特徵。
癌症（Cancer）： 癌細胞能在極端惡劣的微環境中存活並蓬勃生長。

演講者的研究團隊嘗試從兩個互補的視角來解析細胞壓力回應：

轉錄與轉譯的選擇性（Transcriptional and translational selectivity）： 在正常狀態下，細胞主要表現驅動細胞譜系（lineage-driving genes，例如維持心臟細胞或腎臟細胞特性的基因）與維持基本生理運作的家政基因（housekeeping genes）。然而，當細胞受到壓力干擾時，會暫停常態運作，轉而專一性地表現應對該壓力所需的基因。這種急性的壓力回應對於細胞的短期生存及長期適應至關重要。然而，細胞如何在壓力下實現高度專一的轉錄與轉譯選擇性，目前機制仍不完全清楚。
生物分子凝集體的動態形成（Biomolecular condensates）： 細胞會將相當大比例的生物分子（特別是轉錄組與蛋白質組）聚集於無膜分腔（membraneless compartments）中，演講者實驗室私下稱之為「斑塊（blobs）」。在初始階段，這些無膜結構可透過液–液相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS）的物理化學原理來解釋。這些凝集體（condensates）是壓力回應的核心特徵，但其具體功能、調節機制以及當物理／物質特性改變時如何導向疾病病理，仍有待釐清。

Slides 延伸補充：根據投影片展示，引發細胞命運改變的壓力干擾源包括病原體（Pathogens）、致癌活性（Oncogenic activity）、細胞毒性／細胞靜止藥物（Cytostatic/toxic drugs）、力學壓力（Mechanical stress）、活性氧類（ROS）、滲透壓壓力（Osmotic stress）、缺氧／營養剝奪（O2/Nutrient deprivation）及冷熱溫度壓力（Heat/cold）。無膜凝集體主要包括核內的核壓力體（Nuclear Stress Bodies）與細胞質內的壓力顆粒（Stress Granules），其物理狀態可從液態（liquid）、膠態（gel）進展至固態聚集體（solid aggregate）。預印本研究成果已發表於 bioRxiv（Dudley JN, Berends JE, De CK et al.）。

HSF1 與蛋白質適應態

蛋白質品質與數量控制（蛋白質同態／適應態，protein homeostasis/proteostasis）是細胞恆定性的核心。蛋白質品質與結構主要由分子伴侶（chaperones）維持，而數量則由蛋白酶體（proteasome）等降解機制掌控。當細胞受到干擾時，蛋白質極易偏離其正常構型，形成不可溶的聚集體（insoluble aggregates），最終引發細胞死亡。

為了對抗蛋白毒性壓力，從酵母菌、植物到人類均演化出高度保守的機制，其核心調控者為熱休克因子 1（heat shock factor 1, HSF1）：

非壓力狀態： HSF1 通常保持非活性狀態。
壓力狀態： HSF1 主要透過後轉譯修飾（post-translational modifications, PTMs）被活化，結合至 DNA 上，並驅動蛋白質毒性壓力回應（proteotoxic stress response, PSR）基因（尤其是分子伴侶基因）的轉錄，以促進細胞生存。

HSF1 的表現量與功能平衡對生物體極為關鍵：

HSF1 表現量下降： 與壽命縮短及神經退化性疾病密切相關。線蟲實驗顯示，降低或提高 HSF1 表現量會直接改變壽命（hsf-1(RNAi) 顯著縮短壽命）；在路易氏體病（Lewy body disease, DLB）患者的大腦組織中，HSF1 濃度顯著下降，並伴隨活性 Caspase-3（cleaved caspase-3，細胞凋亡指標）的增加。
HSF1 表現量過高： 則與癌症進展及不良預後呈正相關。在骨肉瘤（osteosarcoma）與乳癌（breast cancer）中，高 HSF1 表現或高 HSF1 轉錄特徵標記（HSF1-CaSig）患者的整體存活率（overall survival）顯著低於低表現患者（p = 0.0017 與 p < 0.0001）。在頭頸癌中，腫瘤區域的分子伴侶總量亦遠高於鄰近正常組織。

癌細胞高度依賴 HSF1，這是因為癌細胞的蛋白質合成速率極高。演講者實驗室測量發現，癌細胞單位時間內的蛋白質合成量約為正常細胞的 10 至 1,000 倍，因此需要更強大的蛋白質同態維持能力。

數據分析與實驗驗證進一步證實：

根據 DepMap 數據，癌細胞對 HSF1 的依賴性（dependency score）顯著高於對單一分子伴侶甚至某些傳統致癌基因（oncogenes）的依賴，展現出典型的非致癌基因成癮性（non-oncogene addiction）。
在實驗室建立的 HSF1 基因剔除（HSF1-knockout, UHKO）細胞株中，細胞不僅對環境壓力與傳統蛋白毒性模型化合物 MG132 極度敏感，對 HSP990 和 JG98 等蛋白毒性標靶藥物的敏感度也大幅增加。

去勢後前列腺中的 HSF 基因計畫

演講者團隊結合了單細胞多組學（single-cell multiomics，包含單細胞 RNA 測序與單細胞 ATAC 測序）與空間轉錄組學（spatial transcriptomics），解析小鼠前列腺的組織結構及其對去勢（castration）的回應：

前列腺葉的譜系特異性： 小鼠前列腺的各個腺葉（AP、DP、LP、VP）由不同的管腔上皮細胞（luminal epithelial cells）組成，具備明確的發育譜系與特異基因表現。
去勢引發的轉錄重塑： 在去勢後，原本驅動細胞譜系的基因（如 Gata3、Foxa1）表現量下降，細胞開始轉而表現幹細胞特性（stemness）與壓力回應基因計畫（stress response gene programs，例如 Fosl1、Klf6）。
臨床相關性： 將小鼠去勢回應基因計畫與人類臨床數據比對發現，該回應與接受雄性激素剝奪療法（androgen deprivation therapy, ADT）的前列腺癌患者基因計畫高度吻合，且部分計畫在去勢抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）中持續維持高表現；其中熱休克因子（HSFs）相關計畫是講者指出的關鍵面向之一，但這項比對本身不等同於已證明 HSF 是臨床疾病進展的直接驅動因子。

Slides 延伸補充：投影片展示了小鼠前列腺各葉（LE-AP、LE-DP、LE-LP、LE-VP、LE-Stem）的單細胞解析地圖（Cho and Zhang et al., PNAS 2025），去勢退化過程（involution）伴隨轉錄因子（TMs）從譜系驅動型向壓力與幹細胞型態轉換，並在人類 ADT 與 CRPC 轉錄組中展現出高度一致的 GSVA 活性評分。

壓力與癌症中的 HSF1 核內焦點

廣泛的文獻顯示，熱休克因子在酵母菌、植物及人類細胞中，面對多種干擾時均能在核內形成焦點（nuclear foci）。這些干擾包括傳統的熱休克壓力（heat shock）、蛋白酶體功能阻斷（如 MG132 處理）、脯胺酸類似物與植物毒素（azetidine-2-carboxylic acid, AZC/ACA）以及重金屬毒素（如 Cd²⁺）。

演講者團隊觀察到：

在內源性（endogenous）表現狀態下，U2OS 骨肉瘤細胞中的 HSF1 在未受壓力時呈相對瀰漫性（diffuse）分佈；給予標準熱休克壓力後，HSF1 在核內迅速形成明亮的點狀結構（puncta）。
將這些細胞小鼠異種移植（xenograft）後，HSF1 在腫瘤微環境中會自發性地形成核內 puncta。
在不同惡性程度的胰臟癌細胞株（如 BxPC-3 及 BxPC-3-KMT2D-KO）中，HSF1 凝集程度隨疾病惡性度增加而提高。此外，臨床腫瘤檢體的免疫螢光染色亦顯示，HSF1 puncta 特異性地存在於腫瘤細胞核中，而未見於基質細胞（stroma）或免疫細胞中。

這引發了一個關鍵的生物物理學問題：凝集作用（condensation）通常會導致兩種不同的生物化學結果——要麼所有組分聚集使化學反應速率上升（轉錄活化），要麼部分組分聚集而其他組分被排除從而使化學反應速率下降（轉錄抑制／隔離）。

Slides 延伸補充：投影片引用 Gaglia et al., Nat Cell Biol 2020 及 Lu et al., Int J Cancer 2023 的數據，顯示在乳癌、結腸癌、肺癌、骨髓瘤與卵巢癌患者組織中，腫瘤細胞（Keratin⁺ 或 CD138⁺）形成 HSF1 foci 的比例（~10-15%）顯著高於基質細胞（aSMA⁺）或免疫細胞（CD45⁺）。

HSF1 凝集體作為轉錄樞紐

為了解答 HSF1 凝集體的功能，研究團隊在 19 種細胞株（包括 5 種正常細胞與 14 種癌症細胞）及秀麗隱桿線蟲（C. elegans）中建立了 9 種不同的壓力模型，透過內源蛋白免疫染色與螢光蛋白標記進行超解析顯微鏡（super-resolution microscopy）定量分析。

1. 凝集是重組事件，而非濃度依賴過程

透過測量核內焦點數量（作為 HSF1 結合基因組位點數量的代理指標）、核分配係數（nuclear partition coefficient，凝集體內與凝集體外的蛋白比例）以及平均螢光強度（MFI，代表核內 HSF1 總表現量）：

在壓力下，HSF1 核內 foci 迅速增加，但核內 HSF1 的總濃度並未上升，甚至略有下降。
這表明 HSF1 凝集體的形成是一個空間重組事件（reorganization event），而非傳統相分離中因蛋白質總濃度超越飽和臨界值（C_sat）所驅動的過程。

2. 轉錄機器的共凝集（Co-condensation）與富集

在非壓力狀態下，HSF1 與 RNA 聚合酶 II（RNA polymerase II, RNA Pol II）均呈瀰漫性分佈。當給予蛋白毒性壓力（熱休克）時：

HSF1 與 RNA Pol II、活化型磷酸化 RNA Pol II（RNA Pol II-5P、RNA Pol II-2P）及新生 RNA（nascent RNA）發生高度共凝集（co-condensation）。
啟動子與增強子標記的差異： 代表啟動子區域的 H3K4me3 未形成 puncta；相反地，代表增強子（enhancer）活性標記的 H3K27ac、BRD4 以及 Mediator 複合體（MED1、MED12）均顯著共凝集。
定量分析顯示，轉錄活性機器與增強子標記的富集指數（enrichment index, E.I.）高於背景，而異染色質標記（H3K27me3、H3K9me3）未被富集；因此這些 puncta 較符合選擇性共富集的轉錄樞紐，而非所有核內成分的非特異聚集。

3. HSF1 是轉錄樞紐形成的必要條件

在使用 HSF1 基因剔除（UHKO）細胞株進行壓力處理時，BRD4、H3K27ac、Mediator 複合體及 RNA Pol II 的凝集均大幅受損，且分子伴侶基因 HSPA1A 未出現親代 U2OS 細胞的熱休克誘導。這支持在此 U2OS／UHKO 實驗模型中，HSF1 是蛋白毒性壓力下核內轉錄樞紐（transcription hubs）組裝所必需的上游成分。

4. 轉錄機器的階層式共富集

為釐清轉錄機器各組分進入凝集體的順序，研究團隊採用了「平均影像疊加圖（average-image metaplots）」分析技術：

抑制 CBP/p300（使用 A-485）： H3K27 乙醯化顯著下降，同時 BRD4 與 RNA Pol II 在凝集體的共富集程度下降，但 MED12 的共凝集仍可維持。
抑制 BRD4（使用 OTX015）： H3K27ac 保持不變，但 BRD4 與 RNA Pol II 的共富集顯著減少。
這表明在 HSF1 形成凝集體後，轉錄機器的招募存在逐步（stepwise）組裝的階層順序，其中 HSF1 與 MED12 的相互作用可能處於較早期的步驟。

後轉譯修飾與 HSF1 結構域需求

1. 後轉譯修飾（PTMs）的驅動作用

HSF1 已知有至少 41 種後轉譯修飾。研究團隊以 Ser320 磷酸化（pS320）作為 HSF1 活化的指標：

西方墨點法與免疫螢光染色顯示，熱休克後 HSF1 發生顯著的凝集與 pS320 磷酸化修飾。
若使用環己醯亞胺（cycloheximide, CHX）干擾蛋白質合成；既有研究顯示此處理可降低壓力下的 HSF1 活化，而實驗中熱休克誘導的 HSF1 核分配百分比（partition percentage）也大幅下降。這支持活化相關 PTMs 參與第一型壓力下 HSF1 重組為 puncta；講者將其描述為重要因素，而非已證明的單一充分機制。

2. 結構域（Domains）對凝集與功能的調控

HSF1 包含有序（ordered）結構域與無序（disordered）結構域：

有序結構域： N 端 DNA 結合域（DNA-binding domain, DBD）、三聚體化域（trimerization domain / LZ1–3）。
無序結構域： 限制域／調節域（regulatory domain, RD）、活化域（activation domain, AD）。
LZ4 結構域。

演講者團隊將各式結構域缺失變體（HaloTag-labeled variants）以接近內源性的濃度重新表現於 UHKO 細胞中，觀察其凝集行為與轉錄富集能力：

HSF1 變體構型	壓力狀態下的凝集能力（Condensation）	轉錄機器共富集與轉錄活性（Function）	結構域功能歸納
全長（FL）	正常凝集	正常富集轉錄機器並高度轉錄	標準野生型對照
缺失 DBD（ΔDBD）	完全無法凝集	無法運作	有序 DNA 結合域為凝集所必需
缺失 LZ1–3（ΔLZ1–3）	完全無法凝集	無法運作	有序三聚體化域為多價結合與凝集所必需
缺失 LZ4（ΔLZ4）	凝集仍可發生	本段未單獨建立完整功能結論	對凝集本身無顯著影響
缺失 AD（ΔAD）	正常凝集	無法富集轉錄機器	內源無序 AD 不影響凝集，但作為招募共因子的「配接平台（landing pad）」
缺失 RD（ΔRD）	非壓力下即自發性凝集	富集所有轉錄機器，但無法招募轉錄活性 RNA Pol II	內源無序 RD 是凝集的負向調節域；缺失後形成「處於預備狀態但無法轉錄（poised but inactive）」的凝集體

Slides 延伸補充：投影片展示了 HSF1 各區域的 PONDR 內源無序預測圖（disorder score），顯示 RD 與 AD 具備極高的無序評分。在 ΔRD 變體中，即便在非壓力（Mock）條件下，其核分配百分比即高達 ~22%，並高度富集 MED12、H3K27ac 與 BRD4，但 RNA Pol II-5P 及 RNA Pol II-2P 的富集信號完全缺失。

第一型與第二型壓力誘導之 HSF1 凝集體

研究團隊進一步將評估擴展至多種不同類型的壓力干擾，發現 HSF1 凝集體並非全貌一致，而是可明確分為兩大類功能迥異的狀態：

1. 第一型壓力凝集體（Type I Condensates，如熱休克 Heat Shock）

特徵： 表現高水平的 HSF1 pS320 活化修飾，高度共富集 RNA Pol II、活化型 RNA Pol II-5P/2P、BRD4、MED12、H3K27ac 及新生 RNA。
功能： 為具有轉錄活性的「轉錄樞紐（transcription hubs）」，驅動 PSR 基因高強度表現。

2. 第二型壓力凝集體（Type II Condensates，環境、代謝與化療壓力）

研究團隊彙整了 183 次超解析顯微鏡實驗、涵蓋超過 10,000 個細胞核與約 200,000 個凝集體 的數據，發現多種壓力會使凝集體阻滯（arrest）於轉錄樞紐組裝的不同階段：

AZC/ACA（植物毒素／脯胺酸類似物）： 凝集體可招募 RNA Pol II，但無法推進至活化型磷酸化狀態。
重金屬毒素（如氯化鎘 CdCl₂、亞砷酸鈉 SA）： 可招募早期因子，但無法招募 RNA Pol II。
氧化壓力（如雙氧水 HP）與化學缺氧（如氯化鈷 CC）： 凝集體中完全缺乏 BRD4 與 RNA Pol II。
代謝壓力（甲基乙二醛 Methylglyoxal, MGO）與化療藥物（三氧化二砷 Arsenic Trioxide, ATO）： 幾乎不富集所檢測的轉錄共因子，顯示 hub assembly 停在更早期的階段。

3. 第二型凝集體的形成機制與基因組效應

PTM 非依賴性： 與第一型不同，給予環己醯亞胺（CHX）處理不會抑壓反而會增加 MGO 等第二型壓力下的 HSF1 凝集百分比。然而，其凝集仍嚴格依賴於 DBD 與 LZ1–3 結構域。
全基因組結合與轉錄輸出下降： 透過 CUT&RUN（基因組結合位點測序）與 BrU-seq（新生 RNA 測序）並加入外源 spike-in 對照，結果顯示相較於第一型熱休克，第二型壓力下 HSF1 的全基因組佔據量（occupancy）與 PSR 轉錄計畫的誘導幅度一致下降。這不代表第二型壓力完全沒有誘導，而是誘導程度較弱。

相異之物質特性與可逆性

為了探討不同壓力下凝集體的物理狀態，研究團隊開發了一套雙色單分子追蹤（single-molecule tracking, SMT）標記策略：以低濃度（1x）JF549-HaloTag 配體標記單分子，同時以高濃度（1000x）JF646-HaloTag 配體標記整體凝集體，從而在活細胞中同時觀測凝集體邊界與單個 HSF1 分子的擴散軌跡。

分子動態性（Dynamics）： 第一型熱休克凝集體內的 HSF1 分子保持較高動態擴散（擴散係數 $D = 0.0279\ \mu\text{m}^2/\text{s}$ ）；而第二型化學缺氧（CC）凝集體內的分子動態性明顯較低（ $D = 0.00304\ \mu\text{m}^2/\text{s}$ ）。這支持兩者具有不同物質特性，但單靠此擴散係數尚不能把第二型凝集體正式定義為膠態或固態。
解聚可逆性（Reversibility）： 當解除第一型壓力（熱休克後恢復至 37°C）時，HSF1 凝集體會解聚溶解（dissolve）；相反地，第二型壓力形成的凝集體在恢復期仍較持久。講者將此現象類比為 Lewy body disease 或神經退化中可能見到的持續性聚集，但未主張兩者已被證明是同一病理機制。
轉錄機器的隔離（Sequestration）效應： 第二型凝集體不僅無法活化 HSF1 自身的標的基因，更會將 HSF1 以及部分轉錄機器「扣押／隔離（sequester）」於非活性凝集體中，使其無法參與細胞內其他基因的轉錄。

可能的干預視角與模型總結

這項研究提出一個概念性範式：觀察 HSF1 與其他轉錄因子時，除了活化、DNA 結合與轉錄之外，也可從凝集（condensation）、解聚（dissolution）、共凝集受阻（inhibition of co-condensation）或進入非活性聚集狀態（promoting inactive aggregation）理解其功能。這些方向目前是機制與標靶概念，尚不是已完成臨床驗證的癌症治療策略。

現場問答

在非熱休克（第二型）壓力下，其他轉錄因子是否會在別處形成轉錄凝集體？當 HSF1 凝集體未富集轉錄機器時，細胞整體的轉錄是否被抑制？

Sethu Pitchiaya 博士： 是的，這是一個非常好的問題。當我們觀察 HSF1 凝集體時，在第二型壓力（如氧化壓力）下，轉錄機器確實沒有被招募至 HSF1 凝集體中。然而，我們觀察到其他壓力特異性的轉錄因子會在別處形成凝集體並招募轉錄機器——例如在氧化壓力下，抗氧化回應轉錄因子 NRF2（NFE2L2）會形成凝集體並富集轉錄機器；在化學缺氧或真實缺氧下，HIF-1α 會形成凝集體並主要富集啟動子轉錄機器。

因此，細胞整體的轉錄並未完全關閉。但 HSF1 凝集體在這些第二型壓力下會將部分轉錄機器抽離（pull away）。如果我們將 HSF1 剔除，原本被 HSF1 隔離的轉錄機器就能釋放並前往其他壓力回應凝集體中。

U2OS 是非常平扁且適合顯微鏡觀察的模型，但在核受體相關的癌細胞（如前列腺癌）中，是否也能看到這些現象？核激素受體是否會與 HSF1 共定位或受其調控？

Sethu Pitchiaya 博士： U2OS 確實是非常理想的顯微鏡實驗模型，但我們付出了巨大的努力，在 19 種不同的細胞株中重複驗證了這些發現，其中包括前列腺癌細胞株 LNCaP、22Rv1、PC3 與 DU145。在所有這些前列腺癌細胞中，HSF1 的凝集規律與運作範式是一致的。

關於雄性素受體（AR）：AR 凝集體在細胞內確實更難直接觀察，需要超解析顯微鏡來精確定量。我們研究了分子伴侶抑制劑對 AR 的影響：當抑制特定分子伴侶時，分子伴侶從 AR 上釋放，AR 被活化；與此同時，我們觀察到 HSF1 的凝集程度顯著增加。不過，我們目前尚未直接確認 AR 與 HSF1 是否存在直接的物理相互作用。

每個細胞核內大約有多少個 HSF1 分子？

Sethu Pitchiaya 博士： 我記得細胞核內 HSF1 的整體莫耳濃度約為 400 nM。透過超解析顯微鏡定量：在較大的介觀（mesoscale）凝集體中，包含數百個（hundreds） HSF1 分子；在較小的微型凝集體中，則包含數十個（a few tens） HSF1 分子。至於整個細胞核內的絕對分子總數，我手頭暫時沒有精確數字。

誘導 HSF1 形成不同類型凝集體的分子觸發機制（mechanistic trigger）是什麼？不同壓力是否會影響 HSF1 的蛋白表現量？

Sethu Pitchiaya 博士： 這是一個非常核心的機制問題。首先，不同壓力可能透過改變 HSF1 的後轉譯修飾（PTMs），影響其凝集屬性。其次，某些壓力可能直接修飾 HSF1；演講者以實驗室正在進行中的發現為例，甲基乙二醛（MGO）可在 HSF1 上形成糖化加合物（glycated adducts），團隊目前認為這可能促使 HSF1 形成高密度、類聚集體且無法招募轉錄機器的凝集體。這是尚待完整驗證的機制模型。

關於表現量問題：在這些實驗所採用的短時間壓力處理（acute time scales）下，團隊未觀察到 HSF1 總蛋白質表現量改變；因此目前資料較支持空間重組與修飾狀態變化，而不是蛋白濃度上升所造成的凝集。