巨噬細胞功能狀態的差異性表觀基因組與轉錄程式化（Differential Epigenomic and Transcriptional Programming of Macrophage Functional States）

會議／場次： ENDO 2026；SY43 — Steroid Receptor Actions in Immunity
短講： SY43-02 — Differential Epigenomic and Transcriptional Programming of Macrophage Functional States
講者： Inez Rogatsky, PhD

整理稿

從發炎性巨噬細胞到 homeostatic macrophage

主持人介紹 Inez Rogatsky 博士後，講者先說明實驗室長期關注的是發炎反應的轉錄調控。發炎是身體對感染或損傷的正常反應；單核細胞會移入感染部位並分化成發炎性巨噬細胞，製造多種介質，以形成有利於清除感染的環境。但過度發炎也會傷害宿主，因此全身層級會啟動下丘腦—垂體—腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis）的回饋控制。腎上腺皮質產生的 glucocorticoids 經廣泛表達的 glucocorticoid receptor（GR）作用於巨噬細胞，可抑制其遷移與發炎介質產生；GR 會結合許多 coregulators，其中 GRIP1／NCoA2 是講者實驗室多年研究的核心。

巨噬細胞可來自不同前驅細胞、定居於不同組織 niche，因而具有不同的 transcriptome 與功能。位於發炎性巨噬細胞光譜另一端的是參與組織修復與恆定維持的 homeostatic macrophages，也就是傳統上稱為 M2 macrophages 的族群。講者帶著幽默提醒，M2 分類雖曾備受爭議，近年又因名稱簡短而常被使用；這裡的 M2 是實驗操作上的稱呼，不表示所有組織巨噬細胞都能被二分成固定狀態。

第 2 型細胞激素 IL-4 可活化 STAT6，進而誘導多個 M2-associated genes；其中 STAT6 的下游轉錄因子 KLF4 常被視為此程式的重要 master regulator。

IL-4 與 glucocorticoid 轉錄程式的交會

巨噬細胞暴露於 glucocorticoids 約 24 小時後，外觀與部分功能很像 M2 macrophages。團隊因此比較小鼠 bone marrow-derived macrophages（BMDMs）經 IL-4、小鼠內源性 corticosterone，或強效合成 glucocorticoid dexamethasone（Dex）處理後的基因表達。

PCR 與 transcriptomic analysis 顯示：

Klf4、Klf9、Mrc1 在不同 M2-like populations 中均被誘導。
Arg1 與 Pparg 主要由 IL-4 程式誘導；Hif3a 與 Gilz 則主要回應 glucocorticoids。
相對於未極化的 M0，M2 IL-4 約有 700 個 differentially expressed genes（DEGs），M2 Dex 約為其一半；M2 Dex 的 DEGs 中約 30%也在 M2 IL-4 改變。
共同下調者包括 Tnf、Cxcl14、Ifit1，共同上調者包括 Klf family、Ccl24、Chil3。

ATAC-seq 所見的 chromatin accessibility，以及 H3K27ac 所代表的 enhancer landscape，在差異 peak 數量與兩種刺激間的重疊比例上，也呈現與 transcriptome 類似的格局。不過，重疊不代表兩條訊號完全相同；後續功能實驗正是要找出它們共享與分流的調控節點。

先前工作顯示 GRIP1 與 KLF4 有 physical interaction，且 GRIP1 可作為 KLF4 coactivator。團隊遂以 LysM-Cre 建立 myeloid-cell-specific Grip1 deletion，在 2 種 genotype、4 種 polarization state，共 8 個 cell populations中比較結果。無論是兩路徑共用、IL-4-specific 或 glucocorticoid-specific genes，GRIP1 缺失都會削弱部分基因的誘導。全基因組分析中，共用 gene cluster 的 GRIP1-dependent fraction 最大；glucocorticoid-specific cluster 約四分之一依賴 GRIP1，IL-4-specific cluster 也有相當比例受影響。這支持 GRIP1 參與兩種程式的交會，但並不表示所有相關基因都由同一複合體直接控制。

PPARγ、GRIP1 與 enhancer occupancy

另一個促進 M2-like phenotype 的核受體是 PPARγ。它是 type II nuclear receptor，與 RXR 形成 heterodimer；不需 ligand 便可位於細胞核並結合 DNA。Ligand 的作用主要是促使 corepressor complexes 與 HDACs 離開，再換入 p160 family、GRIP1 等 coactivators，並招募 histone acetyltransferases 以活化轉錄。

Maria Dacic 先注意到，既有 PPARγ-knockout data 中的 PPARγ-dependent genes，與實驗室的 GRIP1-dependent genes 很相似。因跨實驗室資料不能直接視為同一實驗證據，她以相同的 LysM-Cre 系統重新建立 myeloid PPARγ knockout。結果顯示，M2 IL-4 條件下在 PPARγ knockout 無法正常上調的部分 genes，在 GRIP1 knockout 中也有相近缺陷；已知 PPARγ enhancers 的 enhancer RNA（eRNA）亦呈現相似變化。這些結果提示兩者可能在同一調控架構內合作，但僅憑共同 target genes 還不足以證明它們位於同一 complex。

進一步建立 M2 IL-4 macrophage 的 PPARγ cistrome，並與先前發表的 GRIP1 cistrome 疊合後發現：

超過一半的 PPARγ peaks 與 GRIP1 peaks 重疊；這些 peaks 可分成 prebound 與 IL-4 後才明顯出現的 de novo groups，並富集 PPRE 與 RXRE motifs。
超過 60% 的 p300 peaks 至少與一個 PPARγ peak 重疊，且訊號在 IL-4 polarization 後增加。
原始預測是 GRIP1 deletion 會先妨礙 p300 recruitment；實際數據卻顯示，GRIP1 缺失時 PPARγ binding 本身即大幅下降，prebound 與 IL-4-dependent sites 都受影響，p300 binding 也隨之下降。
這並非全域 chromatin accessibility 一起下降。相反地，在失去 PPARγ 的 enhancers、鄰近區域與相關 promoters，出現高度局部化的 CTCF loading；若看全基因組 CTCF volcano plot，wild type 與 GRIP1 knockout 並沒有單向的整體改變。

講者據此提出模型：GRIP1 可能協助穩定 enhancer transcriptional complex；GRIP1 缺失後，PPARγ occupancy 降低，而 CTCF 在特定 enhancer／promoter regions 增加。這是由 cistrome 與局部 chromatin data 支持的工作模型，不能直接延伸成 GRIP1 對所有 PPARγ sites 都具有相同作用。

吞噬作用與 efferocytosis 的分流

團隊先用在 phagosome 酸性環境中發光的 pHrodo particles 測量基礎 phagocytosis。各種 M2-polarized populations 的 particle uptake 均上升，而且這項增加大致依賴 GRIP1。然而，生理上巨噬細胞每天處理的是數千億個 apoptotic cells；講者引用約 1% 全身細胞每日 turnover 的估計，引出免疫靜默的 apoptotic-cell clearance——efferocytosis。

Apoptotic cells 會釋放 ATP 等 find-me signals，並外露 phosphatidylserine 等 eat-me signals。巨噬細胞吞噬後，還須回收膜成分、排出 cholesterol、提高 fatty-acid oxidation，並壓低 Toll-like receptor responses。

第一組體外實驗以 staurosporine 誘導 Jurkat cells apoptosis，再以 pHrodo 標記，與不同 polarization state 的 BMDMs 共培養 1 小時，以 CD11b、F4/80 與 pHrodo signal 定量。結果不是所有 M2-like states 都相同：

只有 Dex-polarized macrophages 明顯提高 efferocytosis。
IL-4 單獨處理沒有相同提升；IL-4 與 Dex 併用時，IL-4 甚至消除了本實驗中 Dex 的促進效果。
Dex-associated increase 依賴 GRIP1。

為降低特定 apoptosis inducer 或 dye 造成的偏差，團隊加入以 LPS＋interferon-γ 極化的 M1 population，將 apoptosis induction 改成 UV，並把標記改成 CypHer5E；結果仍只有 glucocorticoid-polarized population 提高 efferocytosis。

值得注意的是，基線 RNA-seq heatmap 並未顯示 M2 Dex 的 efferocytosis-related receptors、adaptors、transcription factors 或 metabolic genes 整體高於 M2 IL-4 或 M1；部分反而更低。因此，靜態 transcriptome 不能解釋 M2 Dex 的功能優勢。

3D chromatin 與 two-step model

團隊推測 24 小時 polarization可能已重塑 topologically associating domains（TADs）與 enhancer–promoter loops，遂進行 Arima-HiC，並結合 H3K27ac 與 H3K4me3 CUT&RUN。Hi-C 有 2 個 biological replicates，各約定序 5 億 reads，之後合併分析，總量約 10 億 reads。PCA 中 M1 與其他狀態分得較遠，M2 Dex 與 M2 IL-4 較接近；講者指出所示 component 僅解釋 6% variance，因此這幅 PCA 只支持整體結構差異的初步方向，不能單獨證明功能機制。

團隊再人工整理約 40–50 個 efferocytosis genes，評分各狀態的 enhancer loops 與 hubs；hub 在此指單一 enhancer 發出超過 2–3 個 loops。幾個代表性 loci 顯示：

Il4 locus 的大型 TAD 與新 loops 只在 M1 明顯出現。
Mertk locus 在各狀態都有 loops／hubs，M1 可能略多。
Klf4 locus 的 H3K27ac／H3K4me3 在 M2 Dex 與 M2 IL-4 看似相近，但 enhancer hubs 與 loops 只在 Dex-polarized cells 明顯出現。

整體評分顯示，Dex-polarized macrophages 在這組人工選定的 efferocytosis genes 中富集 enhancer hubs 與 enhancer–promoter loops。這形成「chromatin 已準備好、基線 RNA 尚未全面上升」的假說。

為測試觸發階段，團隊讓巨噬細胞接觸 apoptotic cells 1 小時，再分選出僅接觸／辨識到 apoptotic cells 與已吞入 apoptotic cells 的 populations，立即做 RNA-seq。僅接觸便可快速提高許多 efferocytosis genes，實際吞入後反應更強，而且此格局主要出現在 glucocorticoid-primed macrophages。

講者因此提出 two-step model：第一步是 glucocorticoid 在約 24 小時內建立 histone marks、TADs、enhancer–promoter loops 與 hubs 的 slow priming；第二步是在接觸 apoptotic cells 後約 1 小時內啟動 fast transcriptional response，將細胞推向 professional efferocyte state。這段即時 RNA-seq 只有 2 個 replicates，講者明言展示的是 raw data，無法提供完整統計推論；two-step model 應視為有功能與染色質證據支持、但仍待更多重複與機制實驗驗證的模型。

現場問答

GRIP1 knockout 後 RXR 是否也離開 DNA？

講者回答尚未直接測量 RXR。依 CTCF loading 推測整個 nuclear-receptor complex 可能都已離開，但這仍是待驗證的猜測。

Dex-primed macrophage 吞噬後的存活期是否改變？

目前標準流程只有 24 小時 polarization 後短暫加入 apoptotic cells，團隊尚未延長追蹤，因此不知道吞噬後 viability 或 lifespan 是否與其他 populations 不同。

Apoptotic-cell source 與 tissue context 是否改變反應？

Zeynep Madak-Erdogan 詢問 Jurkat cells 以外的免疫細胞或 tumor microenvironment。講者指出既有文獻支持 apoptotic-cell origin 會影響 macrophage transcriptional response；團隊正以 neutrophils 研究 inflammation resolution，tumor context 也很重要，但本次資料尚未測試其普遍性。

H3K27ac 與其他 transcription-factor motifs

Lee Kraus 詢問 GRIP1 deletion 對 histone marks 的影響。講者表示 knockout 中 H3K27ac 明顯下降；H3K4me1 與 H3K4me3 也測過，但各 modification 的下降並不完全一致。她也指出 PPARγ sites 附近有大量 AP-1 motifs，與 PPRE／RXRE 一樣達到很高的 enrichment significance；團隊尚未深入拆解 AP-1 或其他 factors 是否介入 PPARγ occupancy 的改變。

Cortisol／corticosterone 是否也提高 efferocytosis？

最後一問涉及 macrophage mineralocorticoid receptor 與內源性 glucocorticoids。講者明確回答：efferocytosis 實驗只做過 Dex，沒有做 corticosterone，更不能由本研究推定 cortisol 的功能效果。在先前 polarization study 中，corticosterone 的方向與 Dex 類似但較弱，增加一個 replicate 後才達統計顯著；那項結果不能替代尚未進行的 corticosterone efferocytosis experiment。