# ESR1 突變背景下的 PR 介導抗藥機制（Mechanisms of PR-Mediated Resistance: The Role of ESR1 Mutants）

- **會議／場次：** ENDO 2026／SY04 — The PR Puzzle: Context-Dependent Actions Reveal Therapeutic Potential
- **短講：** SY04-03
- **講者：** Thu H. Truong, PhD（Assistant Professor, Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, Masonic Cancer Center, University of Minnesota）

## 整理稿

### 研究背景：雌激素受體陽性乳癌的復發特性與抗藥機制

乳癌患者的術後復發型態因腫瘤亞型而異。在雌激素受體陽性（estrogen receptor-positive, ER-positive）乳癌中，患者趨向於發生**晚期復發（late relapse）**，即復發常發生在初次診斷並接受治療 5 年之後；且此種復發風險可持續維持高檔長達 20 年，形成患者的終生風險（lifetime risk）。

臨床上，ER 陽性腫瘤主要接受內分泌治療（endocrine therapies），初期治療反應良好，但高達 **40%** 的患者最終會產生獲得性抗藥性（acquired resistance），並進一步進展至遠端轉移（metastasis）。

造成內分泌抗藥性的因素相當複雜，講者實驗室長期專注於**癌症幹細胞（cancer stem-like cells, CSCs）**的研究：
1. **幹細胞特性**：CSCs 增殖能力較低（poorly proliferative），以細胞次族群的形式隱匿於復發性乳癌腫瘤中。
2. **逃脫機制**：CSCs 在治療打擊後存活的能力，使其得以逃脫針對快速分裂腫瘤細胞的標準內分泌及化學療法。
3. **其他關鍵機制**：包括與生長因子等信號通路的交叉對話（crosstalk），以及對 ER 與黃體素受體（progesterone receptor, PR）等類固醇受體的調控修飾。

*演講預告補充*：同屬講者團隊的 Julie H. Ostrander 博士將於週一發表關於類固醇受體共調節因子（steroid receptor coregulators）的合作研究，而 Anna Kopin 博士亦將於週一同一場次深入探討 PR 的調控細節。

---

### PR 與 ER 的交互作用及 PR 磷酸化修飾（Ser294）

在乳癌腫瘤生物學中，類固醇受體之間的交叉對話扮演重要角色：
- **傳統觀點**：PR 一直被視為 ER 的下游標的基因（ER target gene），且臨床上長期將總 PR 濃度（total PR levels）作為功能性 ER 的生物標記。
- **結合與調控功能**：近年多項研究證實，PR 本身即為 ER 的直接結合夥伴（binding partner），並能直接調控修飾 ER 的轉錄活性。
- **激酶磷酸化**：PR 可被多種在乳癌中常出現調控失常的蛋白激酶（protein kinases）磷酸化。Carol A. Lange 博士團隊深入剖析了 PR 磷酸化的角色，特別是在 **Ser294 位點（Ser294 site）** 的磷酸化，證實其會直接促進 CSC 族群的擴增。

這些磷酸化事件使 PR 能夠促進內分泌抗藥性，凸顯了 PR 作為**疾病進展驅動者（driver of disease progression）**的新興角色。儘管臨床上利用 PR 標的策略的手段仍相當有限，但目前已有許多臨床試驗正積極評估其可行性。

---

### ESR1 突變（Y537S 與 D538G）與 PR 的表現特徵

內分泌治療後引發抗藥性的另一個重要機制，是 ER 基因（*ESR1*）配體結合域（ligand-binding domain）發生的獲得性功能（gain-of-function）突變，最常見的突變型別為 **Y537S** 與 **D538G** 突變：
- **分子效應**：這些突變將 ER 穩定在活化構象（active conformation），形成**不依賴雌激素的持續活化 ER（constitutively active estrogen-independent ER）**，進而降低腫瘤對內分泌治療的敏感性。講者並提到，針對 *ESR1* 突變型乳癌已有新藥獲批。
- **影像學發現**：Amy Fowler 博士團隊利用 PET 影像學研究顯示，在 *ESR1* 突變型腫瘤中可觀察到 PR 表現量顯著增加，此特徵或許可作為識別對內分泌治療療效下降的影像生物標記。

**研究問題提出**：
傳統邏輯下，PR 是由雌激素驅動的 ER 標的基因；當受到黃體素（progestin）或生長因子刺激時，PR 會發生轉譯後修飾（post-translational modifications），其磷酸化事件最終改變 PR 對乳癌細胞增殖與轉移的影響。講者團隊在實驗中觀察到 ER-PR 複合物中包含已磷酸化的 PR 物種（phosphorylated PR species），因而提出核心問題：
1. 在 *ESR1* 突變的情境下，PR 的表現與活性發生了何種變化？
2. PR 是否為驅動 *ESR1* 突變體中 CSC 擴增表型的關鍵？
3. PR 的 Ser294 等位點磷酸化在此過程中扮演了何種角色？

---

### Patient-Derived Xenograft (PDX) 模型與細胞株中的 PR 表現與結合驗證

為了驗證 *ESR1* 突變腫瘤中的 PR 狀態，講者團隊與 Colorado 大學 Carol Sartorius 博士團隊合作（由 Amy Dwyer 博士領導研究），利用 ER 陽性 PDX 模型（UCD65 與 UCD4）進行原發腫瘤與轉移灶的免疫組織化學染色：
- **UCD65 模型**：包含 *ESR1* 基因放大（amplified ER gene）。
- **UCD4 模型**：包含 *ESR1* D538G 突變。

**PDX 腫瘤檢測結果**：
研究團隊使用臨床總 PR 抗體以及 Carol Lange 團隊自製的磷酸化 PR 抗體進行檢測，結果顯示：
1. 原發 PDX 腫瘤中含有**非常豐富的磷酸化 PR**。
2. 在 PDX 小鼠的**腦轉移灶（brain metastases）**中，磷酸化 PR 同樣呈現顯著富集（enriched）。

**基因編輯細胞株模型設計**：
為了深入進行機制探討，講者團隊採用由 David J. Shapiro 博士與 Ben Ho Park 博士團隊利用基因編輯技術建立的 T47D 與 MCF7 背景細胞株，分別表現野生型 ER（wild-type ER）或突變型 ER（Y537S 或 D538G）：
- **Western Blot 分析**：在無雌激素（estrogen）的基線條件下，兩種 *ESR1* 突變模型（Y537S 與 D538G）的總 PR 基線表現量均顯著升高。給予合成黃體素 `R5020` 處理後，突變株展現出強烈的黃體素反應性（透過 phospho-PR 抗體檢測）。野生型模型則必須在給予雌激素誘導後，其 PR 表現量才能達到與 *ESR1* 突變株相當的水平。
- **MAPK 磷酸化位點**：PR 在 **Ser294** 與 **Ser345** 兩個 MAPK 磷酸化位點的變化趨勢與總 PR 完全一致。
- **Co-IP 蛋白質交互作用檢測**：共免疫沉澱（co-immunoprecipitation, co-IP）實驗顯示，在未添加外源激素的條件下，野生型模型（T47D 與 MCF7）中可檢測到固有的 ER-PR 交互作用；但在兩種 *ESR1* 突變模型中，該交互作用在無激素狀態下均**大幅減少（greatly reduced）**。
- **PLA 近接結合標定分析**：由研究生 Sai Harshita Posani 完成的近接結合標定分析（proximity ligation assays, PLA；藍色為 DAPI 標定核，紅色螢光點代表 ER-PR 結合）驗證了 co-IP 的發現：
  - **野生型模型**：給予雌激素或 `R5020` 處理均能顯著增加 ER-PR 交互作用。
  - **Y537S 突變模型**：單獨給予雌激素無法增加 ER-PR 結合，**僅有在給予 `R5020` 處理時**才會誘導 ER-PR 交互作用增加。
  - 這顯示在 Y537S 背景下，突變 ER 本身雖具雌激素非依賴性，但 **ER-PR 複合體形成仍可被 progestin R5020 誘導，而 E2 並未增加此交互作用**；不能把兩者簡化為完全不受配體影響。

---

### 癌症幹細胞（CSC）擴增與功能性檢測

鑑於實驗室對 CSCs 的關注，講者團隊進一步評估了 *ESR1* 突變對 CSC 表型的影響：

#### 1. CD44-high/CD24-low 次族群分析
利用流式細胞儀測量乳癌 CSCs 的經典表面標記 CD44-high/CD24-low 比例：
- **2D 貼壁培養**：Y537S 突變株展現出最高程度的 CD44-high/CD24-low 族群增加。
- **3D 腫瘤球培養**：在無血清、超低貼壁盤及腫瘤球培養基（tumorsphere medium）條件下，Y537S 突變帶來的 CD44-high/CD24-low 族群擴增效果被進一步放大。
- **D538G 突變**：在 3D 培養條件下，D538G 突變株的 CD44-high/CD24-low 族群亦顯著高於野生型，但增加幅度低於 Y537S 突變株，且此現象僅在 3D 條件而非 2D 條件下觀察到。

#### 2. 腫瘤球形成實驗（Tumorsphere Assays）與激素依賴性
在體外 CSC 自我更新（self-renewal）實驗中，Y537S 突變株在 T47D 與 MCF7 模型中均展現出顯著增強的腫瘤球形成能力。
- **激素成分解析**：由於標準腫瘤球培養基的專利成分含有背景激素，團隊先以活性碳脫脂（charcoal stripping）去除背景激素，再分別補回 E2 與 `R5020`。在講者展示的這組去除後補回實驗中，**`R5020` 是出現腫瘤球形成反應的關鍵處置**；這是特定細胞與培養條件下的結果。

#### 3. 藥物處置與 shRNA 敲降對比
- **內分泌藥物**：使用傳統內分泌藥物 `tamoxifen` 以及新一代內分泌療法 `elacestrant` 與 `lasofoxifene` 處置，均能顯著抑制野生型與突變型模型的腫瘤球形成能力。
- **抗黃體素藥物（Antiprogestins）**：使用抗黃體素藥物 `onapristone`、`mifepristone (RU486)` 及 `PRA-027` 處置時，在 T47D 模型中**未觀察到可測量的抑制效果**，在 MCF7 模型中僅觀察到微弱（modest）的抑制效果。
- **shRNA 敲降 PR**：由於抗黃體素藥物處置效果有限，團隊轉而採用 shRNA 基因敲降技術抑制 PR 表現（shPR），並將焦點集中於幹細胞表型最顯著的 Y537S 突變：
  - Western blot 證實成功敲降 PR 表現。
  - 腫瘤球實驗顯示：敲降 PR 後，野生型模型的腫瘤球形成減少約 **50%**；而在 Y537S 突變模型中，敲降 PR 使腫瘤球形成顯著降低了約 **75%**（與各自 shGFP 對照組相比）。

---

### 體內（In Vivo）乳腺導管內注射模型與循環腫瘤細胞（CTC）轉移潛力

為了評估 PR 在體內的生理功能，講者團隊與 Minnesota 大學 Julie Ostrander 博士合作，採用由 Cathrin Brisken 博士團隊開創的**乳腺導管內（mammary intraductal, MIND）小鼠模型**：
- **實驗設計**：將 T47D 野生型與 Y537S 突變株（具備 shGFP 對照或 shPR 敲降）直接注射入小鼠乳腺導管結構中，追蹤觀察 8 週。
- **原發腫瘤負擔（Primary Tumor Burden）**：透過 H&E 組織切片量化腫瘤面積。注射 Y537S 突變株的小鼠，其原發腫瘤負擔顯著高於野生型小鼠。然而，敲降 PR 對原發腫瘤負擔的影響呈現分化：在野生型模型中敲降 PR 反而導致腫瘤負擔增加，但在 Y537S 突變模型中敲降 PR 則**未產生可測量或顯著的改變**。
- **循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）轉移潛力**：在採集導管腫瘤的同時採集小鼠血液，分離 CTCs 並進行軟洋菜膠殖落形成實驗（soft agar assays），測量具備致腫瘤與幹細胞特性的細胞存活能力：
  - 注射 Y537S 突變株的小鼠，其血液中分離出的 CTC 殖落形成數量顯著高於野生型。
  - **敲降 PR 能顯著削弱（attenuate）由 Y537S 突變所引發的 CTC 殖落形成能力**，證實 PR 在突變體介導的腫瘤細胞遠端播散與轉移潛力中扮演關鍵角色。

---

### 轉錄組（RNA-seq）與 Genomic Binding（ChIP-seq）分析

#### 1. 2D 轉錄組分析
在 2D 培養條件下，給予雌激素、`R5020` 或二者聯合處置並進行 RNA-seq：
- **野生型模型**：對雌激素（pink）與 `R5020`（blue）均展現出廣泛的轉錄應答。
- **Y537S 突變模型**：**主要的轉錄應答完全來自於黃體素（`R5020`）**。
- **GSEA 通路分析**：野生型模型對 `R5020` 的應答主要富集於 MAP 激酶瀑布信號（MAP kinase cascade）及細胞增殖相關通路；而 Y537S 突變模型對 `R5020` 的應答則轉向富集於**細胞遷移（migration）與轉移（metastasis）**相關通路。

#### 2. Phospho-PR Ser294 ChIP-seq 分析
與 Chicago 大學 Geoffrey L. Greene 博士團隊（及研究生 Rosemary J. Huggins）合作，使用特定 phospho-PR Ser294 抗體進行全基因組結合分析：
- **基線與誘導**：在未給藥（vehicle）條件下，野生型與 Y537S 突變株即展現出不同的 phospho-PR 結合峰；給予 `R5020` 刺激後，兩者均出現大量的結合峰獲得（major gain）。
- **位點差異**：比較 `R5020` 誘發的 phospho-PR 結合位點發現，Y537S 突變模型除了包含野生型共有位點外，**獲得了額外且獨特的 phospho-PR 結合位點（gain in binding sites）**。
- **轉錄因子 Motif**：Motif 分析顯示 Y537S 突變株的 phospho-PR 結合位點顯著富集了與 CSC 通路密切相關的轉錄因子，例如 **SOX** 與 **SOX10**。

#### 3. 3D 腫瘤球 RNA-seq 與通路發現
由於 PR 敲降在 3D 腫瘤球實驗中展現出比抗黃體素藥物更明顯的抑制效果，團隊對 3D 培養下的 T47D（shGFP vs shPR）進行 RNA-seq：
- **PCA 分析**：Y537S 突變是驅動整體基因表現量變異的最大因子。
- **PR 依賴性**：Y537S 突變所誘導的 ER 標的基因表現高度依賴 PR；**當敲降 PR 後，Y537S 誘導的基因表現量被重新拉回至接近野生型基線水平**。
- **3D 通路改變**：在 3D 腫瘤球條件下，Y537S 突變模型的分析顯示**未折疊蛋白反應（unfolded protein response, UPR）**、unfolded protein binding 與缺氧（hypoxia）等壓力相關路徑呈正向富集；這是轉錄體與路徑分析結果，不等同於每一分支皆已完成功能驗證。

---

### 未折疊蛋白反應（UPR）的作用與 UPR 超活化劑 ErSO 的療效

未折疊蛋白反應（UPR）是一種內質網應激（endoplasmic reticulum stress）反應，負責調控蛋白質穩態（protein homeostasis），並與內分泌抗藥性相關。UPR 由三條主要信號分支介導：**ATF6**、**IRE1** 與 **PERK**，可影響蛋白質折疊、細胞凋亡（apoptosis）與脂質生成（lipogenesis）。講者引用 David J. Shapiro 團隊的研究，說明 *ESR1* 突變會改變 UPR 的調控狀態。

#### 1. UPR 表現與 shPR 敲降
針對 UPR 通路關鍵組分的熱圖分析顯示：
- 多數 UPR 組分在 Y537S 突變模型中顯著上調（upregulated）。
- **敲降 PR 能夠有效翻轉此現象，顯著降低 UPR 組分的表現量**。

#### 2. UPR 單一分支抑製劑 vs. UPR 超活化劑 ErSO
團隊測試了針對 UPR 三條信號分支的商業化小分子抑製劑，發現單獨抑制任一分支在野生型或 Y537S 突變模型中的腫瘤球抑制效果均相當溫和（modest）。講者解釋：適度的 UPR 活化對乳癌細胞具備保護作用（cytoprotective），能協助細胞處理龐大的蛋白質折疊需求。

為突破此局限，團隊採用了由 David J. Shapiro 博士團隊開發的小分子 UPR 超活化劑 **ErSO**：
- **作用機制**：`ErSO` 能將 UPR 從「細胞保護性（cytoprotective）」轉向「細胞毒性（cytotoxic）」，誘發腫瘤細胞死亡。
- **實驗結果**：在 3D 腫瘤球實驗中，`ErSO` **極為強效地抑制了野生型與 Y537S 突變模型的腫瘤球形成能力**。
- **對 phospho-PR 的影響**：`ErSO` 處置同時**顯著降低了對 `R5020` 刺激所引發的 phosphorylated PR（Ser294）受體濃度**。
- **研究啟示**：在這些細胞與 3D 腫瘤球模型中，抑制 UPR 單一分支效果有限；UPR 超活化則同時影響 CSC 表型與 R5020 誘導的 phospho-PR。這是值得進一步驗證的**臨床前治療方向**，尚不能推論人體療效或安全性。

<u>目前最可行的解讀是：PR／UPR 軸提供了可追蹤的臨床前機制與候選標的，但尚不足以支持在病人身上直接採用 antiprogestin 或 ErSO 的治療決策。</u>

---

### 總結與研究展望

1. **黃體素反應性**：儘管 *ESR1* 突變體具備非依賴雌激素的特性，但其透過受體交互作用、轉錄組及全基因組結合（ChIP-seq），對黃體素（progesterone）處置仍保持高度反應性。
2. **幹細胞與轉移調控**：敲降 PR 可顯著抑制 *ESR1* 突變株的癌症幹細胞（CSC）族群擴增及循環腫瘤細胞（CTC）轉移殖落形成能力。
3. **UPR 通路機制**：3D 腫瘤球轉錄組把 UPR 指向一條 PR 依賴、可供後續驗證的 CSC 相關路徑；`ErSO` 在講者展示的臨床前模型中效果強，但仍是研究工具與候選策略，而非已確立的臨床治療。

---

### 現場問答

#### Q1：在臨床前模型與患者腫瘤中，雌激素誘導 PR 表現的「鐵律」是否存在例外？
- **提問者（University of Illinois）**：
  演講中提及 PR 是雌激素反應基因。但現在有了越來越多的 PDX 與 PDO 模型，這個「雌激素必然上調 PR 表現」的規律有多堅固？是否存在雌激素無法上調 PR 的例外情況？
- **講者（Thu H. Truong, PhD）**：
  是的，確實存在例外。在 Carol Sartorius 博士實驗室建立的 ER 陽性 PDX 模型中，有一個未接受過治療（treatment-naive）的 ER 陽性 PDX 模型，在其體內完全檢測不到 PR 表現。這是講者目前能立即舉出的例外範例，顯示在真實腫瘤模型中，雌激素對 PR 的誘導反應並非 100% 絕對。

#### Q2：在 ER 突變模型中打擊 PR，如何區分究竟是 PR 本身的功能，還是因為破壞了 ER 的輔因子功能？
- **提問者（University of Colorado）**：
  當考慮在 ER 突變模型中標的 PR 時，如何區分標的 PR 的效果是來自於 PR 本身，還是因為 PR 是 ER 必需的共因子（cofactor）因而干擾了 ER 的功能？如果抑制 PR 等同於間接抑制了 ER，要如何單獨將功能歸因於 PR？
- **講者（Thu H. Truong, PhD）**：
  講者對此問題亦思考許久。雖然 *ESR1* 突變體具備「非依賴雌激素（estrogen-independent）」的特性，但這並不代表它不依賴 ER（ER-independent）。目前講者實驗室的研究生 Jill 正透過更詳細的分子實驗來剖析此問題，重點研究在突變細胞中 PR 究竟與哪些蛋白因子結合（binding partners），以釐清兩者各自的獨立功能與相互依賴關係，目前尚待進一步研究確定（to be determined）。

#### Q3：UPR 超活化劑 ErSO 處理後，PR 磷酸化的改變細節為何？其他位點或後轉譯修飾情況如何？
- **提問者（University of Virginia）**：
  在最後的實驗中，ErSO 處理對 PR 磷酸化產生了非常顯著的抑制效果。請問檢測的是哪一個磷酸化位點？是否有觀察其他磷酸化位點或其他轉譯後修飾（如 SUMO 化）的變化？
- **講者（Thu H. Truong, PhD）**：
  在 `ErSO` 實驗中展示的磷酸化位點是 **Ser294**（Ser294 site）。對於其他 MAPK 磷酸化位點（例如 **Ser345**），講者團隊觀察到了完全相同的抑制趨勢。至於由其他蛋白激酶催化的磷酸化位點，或是 SUMO 化（SUMOylation）等其他轉譯後修飾，目前團隊尚未進行檢測，未來可由 Carol Lange 實驗室或其他團隊進一步深入探討。