Genetic Modifiers of Phenotypic Divergence in Diabetic Retinopathy

講者： Sampathkumar Rangasamy, PhD (Arizona State University)
演講主題： 糖尿病視網膜病變中表型分歧的遺傳修飾因子 (Genetic Modifiers of Phenotypic Divergence in Diabetic Retinopathy)
大會專題： 糖尿病視網膜病變的管理——臨床視角 (Management of Diabetic Retinopathy—Clinical Perspective)

臨床問題與研究背景 (Introduction & Clinical Problem)

本演講的核心目標在於剖析糖尿病視網膜病變（Diabetic Retinopathy, DR）臨床表型異質性（phenotypic heterogeneity）的臨床證據，並深入探討遺傳學在其中扮演的角色。

在臨床上，我們經常面臨一個核心疑問：為什麼在慢性高血糖（chronic hyperglycemia）暴露程度相當的患者中，會分化出截然不同的臨床表型？ 甚至，為什麼有些患有數十年糖尿病的患者，卻能終生不發展出任何糖尿病視網膜病變？

講者團隊提出假設：這種表型分歧（phenotypic divergence）是由遺傳修飾因子（genetic modifiers）所塑造的。為了驗證此假設，研究團隊建立了 DRGen 研究（Diabetic Retinopathy Genetics Study），其基於精確的表型分類設計，旨在找出這些關鍵的遺傳決定因素。

Slides 延伸補充：根據 ETDRS 糖尿病視網膜病變嚴重度分級（Diabetic Retinopathy Severity scale，引用自 Ophthalmology 1991），DR 的病程會隨著時間惡化，其進展線路為：無病變 (No DR) $\rightarrow$ 輕度非增殖性 (Mild NPDR) $\rightarrow$ 中度非增殖性 (Moderate NPDR) $\rightarrow$ 重度非增殖性 (Severe NPDR) $\rightarrow$ 增殖性糖尿病視網膜病變 (PDR)。其中，糖尿病黃斑部水腫（DME）可能在病程中的任何階段發生。然而，臨床上存在一種「極端表型」（Extreme Phenotype），即糖尿病病程超過 20 年卻完全沒有出現 DR 的患者。這顯示單純的系統性高血糖暴露，並不足以完全解釋疾病的進展與臨床表現。

表型異質性與 VEGF 悖論 (Phenotypic Heterogeneity & The VEGF Paradox)

臨床上，PDR 與 DME 的表現往往呈現高度分歧：

患者 A（增殖性病變 PDR）： 表現出廣泛的視網膜新生血管（neovascularization），但儘管眼內血管內皮生長因子（VEGF）濃度極高，卻完全沒有出現黃斑部水腫。
患者 B（黃斑部水腫 DME）： 表現出嚴重的黃斑部水腫、硬性滲出物（hard exudates）與血管滲漏，但儘管同樣處於高 VEGF 環境下，卻完全沒有新生血管形成。

這引發了 VEGF 悖論（The VEGF Paradox）：如果 VEGF 同時是驅動血管滲漏與新生血管形成的主導因子，為什麼這兩種表型在許多患者身上會獨立呈現，互不重疊？

為了評估這種「表型非共存性」（Phenotypic Non-Concurrence），新墨西哥大學（UNM）的 Arup Das 醫師團隊進行了一項佇列研究：

在 PDR 患者中，高達 ~85% 的人並未合併出現 DME。
在 DME 患者中，同樣有 ~85% 的人未觀察到新生血管形成。
進一步分析顯示，糖化血色素（ $\text{HbA1c}$ ）、糖尿病病程以及治療方式等系統性風險因子，皆無法預測這些特定表型的發生風險。這強烈暗示了遺傳因子在決定 DME 與 PDR 表型中扮演了關鍵角色。

Slides 延伸補充：根據 Hobbs 與 Das 於 ARVO 2017 發表之數據，PDR 患者中「無 DME」的比例為 84.3% (95% CI: 78.2-90.5%)，而 DME 患者中「無 PDR」的比例為 79.7% (95% CI: 72.9-86.5%)。這證實了 PDR 與 DME 在分子機制上可能是由獨立的信號級聯反應（signaling cascades）所驅動。

種族在表型異質性中的角色 (Role of Ethnicity in Phenotypic Heterogeneity)

研究團隊進一步探討了背景遺傳（種族）是否會影響 DME 的臨床表型呈現：

美洲原住民佇列（American Indian Cohort, $N = 1,458$ 於 IHS 診所接受治療）：
- 絕大多數（90%）患者呈現非中心累及的局灶型 DME（Non-Center Involving / Focal DME）。
- 此類患者通常僅需觀察或接受局灶/柵欄樣雷射（Focal/Grid Laser）治療，極少需要注射抗 VEGF 藥物。
拉丁裔佇列（Hispanic Cohort）：
- 多數呈現中心累及的彌漫型 DME（Center Involving / Diffuse DME），並伴隨顯著的硬性滲出物。
- 此類患者高度需要頻繁的抗 VEGF 玻璃體內注射治療。
結論： 背景遺傳與種族在塑造糖尿病眼疾的具體臨床表現（如黃斑部水腫的嚴重度與型態）上，發揮了舉足輕重的作用。

DRGen 研究設計與臨床特徵 (The DRGen Study Design & Clinical Characteristics)

DRGen 研究是由新墨西哥大學（UNM）、喬斯林糖尿病中心（Joslin Diabetes Center）、印第安人健康服務局（IHS）以及鳳凰城基因組學研究院（TGen）共同合作開展的多中心研究。

1. 研究對象與分組

研究納入了拉丁裔（Hispanics）、美洲原住民（American Indians）與白人（Caucasians）三大族群，並依據嚴格的臨床表型將患者精確分類為：

無 DR 或極輕度 NPDR 組 (No DR / V. Mild NPDR)： $n = 103$
僅有 PDR 組 (PDR only)： $n = 182$
僅有 DME 組 (DME only)： $n = 77$
混合組 (COMBO, 同時具備 PDR 與 DME)

2. 實驗與分析流程

定序技術： 使用 NovaSeq 6000 進行全外顯子組定序（WES）與全基因組定序（WGS）。
生物資訊分析：
- 利用 GLNexus (v1.4.0) 與 Deep Variant (v1.1.0) 進行聯合變異偵測與註釋。
- 篩選罕見變異（Rare Variants，篩選標準：Qual score > 50, MAF < 0.02, AD > 5）。
- 採用多層次方法（包括電腦模擬預測、VEP 高影響變異預測及通路分層）對候選變異進行優先排序。
功能驗證： 在模擬糖尿病環境（高血糖與晚期糖化終產物，HG AGE）下進行視網膜內皮細胞的體外功能驗證。

3. 臨床特徵對比

對比 PDR 與 DME 兩組患者的臨床數據，結果如下：

糖化血色素 ( $\text{HbA1c}$ ): PDR 組顯著高於 DME 組（ $8.54 \pm 1.97\%$ vs. $7.78 \pm 1.71\%$ , $P < 0.05$ ）。
糖尿病病程 (DM Duration): PDR 組顯著較長（ $26.91 \pm 12.00$ 年 vs. $22.32 \pm 10.53$ 年, $P < 0.05$ ）。
高密度脂蛋白 (HDL): DME 組顯著高於 PDR 組（ $52.28 \pm 15.83$ mg/dL vs. $45.51 \pm 14.91$ mg/dL, $P < 0.05$ ）。
臨床啟示： 雖然上述指標在統計學上達顯著差異，但其臨床變異度極大，單憑這些代謝參數根本無法預測或區分患者未來會發展出哪一種特定表型。

遺傳學結果：PDR 與 DME 的富集基因 (Genetic Results: PDR vs. DME Enriched Genes)

透過罕見變異篩選，研究團隊發現 PDR 與 DME 兩組患者在不同的基因通路中出現了顯著的變異富集：

1. 增殖性糖尿病視網膜病變 (PDR) 富集基因

PDR 患者主要在血管新生（angiogenesis）與纖溶酶原激活物級聯反應（plasminogen activator cascade）的調節基因中富集：

CD36 (Thrombospondin 受體；血管新生的關鍵負調控因子)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr7:g.80661212T>C (rs3211893)，屬於剪接供體變異 (Splice donor variant)，等位基因頻率 (AF) 為 0.0021。
DPP4 (Dipeptidyl peptidase 4)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr2:g.162047503T>C (rs116302758)，屬於剪接受體變異 (Splice acceptor variant)，AF 為 0.0264。
MMRN2 (Multimerin 2)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr10:g.86943601G>A (rs145792105)，屬於無義突變 (stop_gained, p.Gln395Ter)，AF 為 4.88E-05。
SELPLG (Selectin P Ligand)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr12:g.108623695del (rs1565888536)，屬於移碼突變 (frameshift variant, p.Ala221HisfsTer113)，AF 為 0。
PLAUR (Urokinase Receptor)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr19:g.43648892A>G (rs140046361)，屬於終止密碼子丟失變異 (stop_lost, p.Ter336GlnextTer2)，AF 為 0.0002。

2. 糖尿病黃斑部水腫 (DME) 富集基因

DME 患者則主要在調節血管通透性（vascular permeability）與內皮細胞連接（endothelial cell junctions）的基因中富集：

PTGER3 (Prostaglandin E receptor 3)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr1:g.70952979del (rs568967213)，屬於移碼突變 (p.Asn395LysfsTer9)，AF 為 0.005。
MEOX2 (Mesenchyme homeobox 2)
- Slides 延伸補充：變異位點為 chr7:g.15686195_15686196del (rs745896587)，屬於移碼突變 (p.His69GlnfsTer134)，AF 為 0.003。

高血糖環境下的功能驗證 (Functional Validation under Hyperglycemic Conditions)

研究團隊將人類視網膜內皮細胞暴露於高糖與晚期糖化終產物（HG AGE）環境中進行體外實驗，以驗證上述候選基因的病理生理機制。

1. 基因表達量受高血糖抑制

實驗證實，在 HG AGE 刺激 5 天後，PDR 相關保護性基因的 mRNA 表達量皆顯著下降：

CD36：表達量降低約 50%（ $P = 0.006$ ）
DPP4：表達量降低約 40%（ $P = 0.04$ ）
MMRN2：表達量降低約 50%（ $P = 0.003$ ）
機制意義： 高血糖環境本身就會削弱這些具有抗血管新生作用的保護性通路。如果患者基因組中原本就攜帶了使這些基因功能受損的遺傳變異（修飾因子），將會進一步加速「血管新生開關」（angiogenic switch）的啟動，使其極易進展為 PDR。

2. CD36 與 TSP1 通路機制

CD36 是血小板反應蛋白 1（Thrombospondin-1, TSP1，一種強效的內源性血管新生抑制劑）的主要受體。
在正常生理狀態下，TSP1 與 CD36 結合會激活 Fyn/p38/JNK 通路並抑制 PKD1，從而阻斷由 VEGF/VEGFR2 介導的血管新生信號（PLC $\gamma$ 1 $\rightarrow$ PKD1 $\rightarrow$ ERK1/2 及 PI3K/Akt）。
當 CD36 發生突變時，此抗血管新生信號受損。在糖尿病的代謝壓力下，這種遺傳修飾因子會使原本的抑血管增生通路失效，轉向促進血管新生（Increased Angiogenesis），進而誘發 PDR。

3. DPP4 與 MMRN2 的功能角色

DPP4 負責降解腸泌素（如 GLP-1）。臨床研究指出，使用 DPP4 抑制劑（DPP4i）治療與第 2 型糖尿病患者發生玻璃體出血、DME 以及快速進展至 PDR 的風險增加具有相關性。
MMRN2 具有抗血管新生（angiostatic）功能。它能與促血管新生細胞激素（如 VEGF-A）結合，減少其與受體結合的機會，並損害內皮細胞的遷移與管狀組織化。當 MMRN2 因突變受損時，血管新生將失去控制。

極端表型：免於視網膜病變的保護機制 (Extreme Phenotype: Protection from Retinopathy)

研究團隊分析了那些「即使患有長期糖尿病，卻完全沒有出現視網膜病變（No DR）」的極端表型個案。例如，一位患有第 1 型糖尿病（T1DM）長達 38 年的患者，其眼底照相顯示視網膜極其健康，完全沒有任何病變跡象。

1. 免疫與發炎通路的罕見變異富集

基因分析顯示，「No DR」佇列在細胞激素信號傳導通路（Cytokine Signaling pathway）中顯著富集了多個罕見變異。前五大富集基因包括：

TLR5：rs756837891 (p.Gln378Ter)，AF: 2.79E-05（功能：免疫信號/IL-6 調節）
RNASEL：rs74315364 (p.Glu265Ter)，AF: 0.00328（功能：干擾素調節/細胞凋亡）
STIM1：rs118128831 (剪接變異)，AF: 0.007951（功能：鈣離子感測/免疫信號）
EDA2R：rs141501145 (p.Arg92Ter)，AF: 0.000133（功能：調節 NF- $\kappa$ B/TNFR）
OSBPL1A：rs766116535 (p.Cys39Ter)，AF: 0.002（功能：脂質受體/與 IL-6 相互作用）

2. 保護機制

這些基因變異與 TNF- $\alpha$ 和 IL-6 的調控密切相關。在高血糖環境下，這些遺傳變異可能扮演了「疾病修飾因子」的角色，主動抑制了由高血糖引起的慢性、低度視網膜發炎反應，從而保護視網膜微血管免受損傷。

外顯子組關聯分析 (EWAS) 與 EHMT2 基因 (EWAS & EHMT2)

為了在極端表型之間進行無偏見的篩選，研究團隊針對 103 例「No DR」患者與 176 例「PDR」患者進行了外顯子組關聯分析（Exome-Wide Association Study, EWAS），共分析了 8,412 個變異位點（基因組膨脹因子 $\lambda = 1.00643$ ）。

1. 發現 EHMT2 錯義變異

分析在第 6 號染色體上的 EHMT2（Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 2，真染色質組蛋白離氨酸甲基轉移酶 2）基因中，鑑定出一個達到暗示性外顯子組顯著性的錯義變異（missense variant）：

變異形式： p.Thr55Asn（蘇氨酸 $\rightarrow$ 天冬醯胺酸取代）
顯著性： $P = 5.465 \times 10^{-5}$ ，具有潛在的強烈功能性影響。

2. EHMT2 在血管新生中的功能驗證

EHMT2 是一種組蛋白甲基轉移酶，參與表觀遺傳調控（epigenetic regulation）。

內皮細胞管狀形成實驗： 使用 EHMT2 藥物抑制劑 BIX 處理內皮細胞。結果顯示，2 $\mu$ M BIX 處理組的管狀形成數量（Tube count）呈極顯著下降（ $P < 0.0001$ ）。
促血管新生與發炎因子調控： 在視網膜內皮細胞中，利用 BIX（0.5 $\mu$ $μ$ M）藥物抑制 EHMT2，可顯著降低以下關鍵因子的 mRNA 表達量：
- ANGPT2 (Angiopoietin-2，血管生成素-2)：降低約 50%（ $P = 0.005$ ）
- CCL2 (MCP-1，單核球趨化蛋白-1)：降低約 50%（ $P = 0.01$ ）
臨床意義： EHMT2 是一個全新的 PDR 遺傳與表觀遺傳修飾因子。抑制其活性可減少促血管新生與促發炎因子的釋放，使其成為預防與治療 PDR 的潛在新型表觀遺傳藥物標靶。

總結與未來展望 (Summary & Future Directions)

病理機制分歧： PDR（新生血管）與 DME（血管滲漏）是兩種由不同遺傳修飾因子調控的、截然不同的病理生理過程。
保護性遺傳機制： 免受 DR 影響的極端表型個案，其體內攜帶的遺傳變異能有效抑制高血糖引起的發炎反應（如 TNF- $\alpha$ 、IL-6 通路）。
新標靶 EHMT2：鑑定出 EHMT2 為 PDR 的新型表觀遺傳修飾因子，調控 ANGPT2 與 CCL2 的表達。
未來研究方向：
- 在更大規模、跨種族的縱向佇列中驗證並複製上述發現。
- 將這些遺傳標記物轉化為臨床診斷工具，用於糖尿病患者的早期風險分層。
- 開發針對遺傳/表觀遺傳修飾因子的新型藥物，以預防高風險患者進展為 PDR。
- 整合多體學（multi-omics）數據，完整描繪罕見修飾因子與環境因素之間的相互作用網絡。

問答環節 (Question & Answer Session)

問題 1（聽眾）：
「非常精彩的演講。我有一個簡單的問題：這些遺傳修飾因子（genetic modifiers）到底是什麼？您能進一步闡述它們的概念嗎？」

答（Sampathkumar Rangasamy 博士）：
「謝謝您的提問。遺傳修飾因子的概念最初源於對單基因遺傳病（monogenic disorders）的研究。在單基因疾病中，患者攜帶相同的致病突變，理論上應表現出相同的疾病嚴重度。然而臨床醫生發現，即使攜帶完全相同的突變，不同患者的病情嚴重度卻有天壤之別。這種差異正是由基因組中其他位置的變異——即『遺傳修飾因子』——修飾了最終的表型結果所致。

在像糖尿病視網膜病變這樣的複雜疾病中，主要的『環境』驅動因子是高血糖。儘管面臨相同的系統性代謝壓力，個體體內的遺傳修飾因子會決定其命運：有些人的變異能提供保護，而有些人的變異則會將疾病推向特定的病理方向，例如引發新生血管（PDR）或血管通透性增加（DME）。」

問題 2（聽眾）：
「所以，這聽起來更像是表觀遺傳學（epigenetics）的範疇？」

答（Sampathkumar Rangasamy 博士）：
「我們這裡鑑定出的是純粹的遺傳學變異（pure genetic variants），特別是對蛋白質功能有強烈影響的編碼區變異（coding variants）。許多這類變異在正常生理狀態下可能是『靜默』且無害的，但在糖尿病的代謝壓力（高血糖、發炎）下，它們對疾病進展的影響就會被顯著放大。

這與 PCSK9 的發現非常相似：某些個體攜帶的 PCSK9 基因變異能保護他們免受高 LDL 膽固醇的危害。同樣地，我們正在視網膜血管通路中尋找這些編碼區變異，它們在糖尿病高糖壓力下，能決定視網膜是受到保護，還是加速走向病變。」

Take-home Summary

臨床診斷思維轉變： 臨床醫生應認識到 PDR 與 DME 並非單一疾病的連續階段，而是兩種在遺傳學上高度分歧的獨立病理過程。這解釋了為何部分患者僅表現出單一表型，且對特定治療（如抗 VEGF）的反應存在個體差異。
精準醫療與風險分層： 未來可望透過基因檢測（如篩選 CD36、DPP4、EHMT2 等變異），在糖尿病早期即對患者進行 PDR 或 DME 的發生風險分層，實現真正的預防性精準醫療。
表觀遺傳治療新契機： EHMT2 作為組蛋白甲基轉移酶，其抑制劑（如 BIX）在體外展現出強效的抗血管新生與抗發炎作用，為未來開發非 VEGF 依賴型的 PDR 預防與治療藥物開闢了新途徑。