Endothelial Metallothionein Enables VEGF Therapy in Diabetic Ischemic Wound Healing
糖尿病血管病變與 VEGF 療法的臨床挑戰
糖尿病缺血性傷口（Diabetic ischemic wounds）在臨床上一直是極具挑戰性的棘手病症，主要原因在於血管新生受損（Impaired angiogenesis）與內皮細胞功能障礙（Endothelial cell dysfunction）。這些病理改變源於高血糖（High glucose）、胰島素阻抗（Insulin resistance）以及組織對於血管內皮生長因子（VEGF）療法的無反應性（Unresponsiveness to VEGF therapy），最終導致糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulcer, DFU）的發生。
根據臨床數據顯示，相較於其他類型的傷口，糖尿病足潰瘍的發生率高達 30% 至 40%。為了重建血流，臨床與研究上常嘗試使用 VEGF 基因或蛋白療法。VEGF 作為一種強效的血管生成因子，能促進新血管形成並保護血管內皮。然而，單純的 VEGF 療法在臨床應用上面臨極大限制：
半衰期極短（Shorter life span/half-life）。
低配體濃度下無法誘導足夠反應。
在高濃度給藥時，會產生嚴重的細胞毒性並誘導活性氧（ROS）堆積。
糖尿病微環境下受體信號傳導受損（Impaired receptor signaling）。
為了克服這些瓶頸，研究團隊採用無偏向性的體學（Unbiased omics）研究方法，期望尋找能夠協同並增強 VEGF 療法的關鍵靶點分子。
Slides 延伸補充：糖尿病組織血管病變的多重病理機制 根據文獻（Fadini et al., 2019），糖尿病組織的血管病變涉及多個層面： - 對缺氧失去反應：低氧誘導因子-1α（HIF-1α）不穩定，導致 VEGF 釋放減少。 - 一氧化氮（NO）生體可用率降低：晚期糖基化終產物（AGEs）堆積、活性氧（ROS）增加引發 NO 清除（NO scavenging）以及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）去活化。 - 骨髓信號受損：促血管生成細胞（Pro-angiogenic cells）動員缺陷與幹細胞動員障礙。 - 這些機制共同導致了嚴重的「VEGF 阻抗性（Unresponsiveness to VEGF）」，進而引發危及肢體的嚴重缺血（Critical limb-threatening ischemia, CLTI）、潰瘍甚至壞疽（Gangrene）。單細胞轉錄組學篩選：鎖定金屬硫蛋白（Metallothionein）
研究團隊對人類糖尿病與非糖尿病患者的靜息皮膚（Resting skin）進行了單細胞 RNA 定序（scRNA-seq）分析。在獲得的 36,487 個單細胞中，共鑑定出 12 個細胞群（Clusters）：
細胞群 0（Cluster 0） 定義為血管內皮細胞群，其特徵為特異性高表達 CDH5（VE-Cadherin）、VWF（Von Willebrand factor）與 PECAM1（CD31）等標誌基因。
VEGF 配體與受體表達分析：令人驚訝的是，在糖尿病與非糖尿病皮膚的內皮細胞中，VEGF 受體與配體的基因表達量並沒有顯著的統計學差異。
基因富集分析（GSEA）：針對經典 VEGF 通路（KEGG_VEGF_SIGNALING_PATHWAY）進行富集分析，雖然糖尿病組呈現負向評分（Normalized Enrichment Score, NES = -0.43），但並未達到顯著差異（p = 0.4）。這顯示糖尿病內皮細胞的 VEGF 阻抗性，並非單純由 VEGF 配體或受體數量減少所致。
為了找出在糖尿病內皮細胞中真正被抑制的關鍵基因，研究團隊進一步比對了糖尿病與非糖尿病內皮細胞的差異表達基因。分析顯示，金屬硫蛋白（Metallothionein, MT）家族基因在糖尿病皮膚內皮細胞中顯著下調。
研究人員透過雷射捕獲顯微切割技術（Laser Capture Microdissection, LCM）分離出人類皮膚中的 CDH5+ 血管內皮成分進行驗證。結果證實，糖尿病患者體內的 MT1E 與 MT2A 基因表達量較非糖尿病患者顯著下降（p < 0.05）。
傷口癒合過程中的時空動態表達分析
為了釐清金屬硫蛋白在傷口癒合各個階段的生理角色，研究團隊在非糖尿病小鼠傷口模型中進行了時空動態分析（Spatiotemporal analysis）：
實驗採用 4mm 的全層皮膚傷口，並在受傷後不同時間點（Day 0, 1, 3, 7, 14）針對傷口區域進行徑向分區（Radial partitioning）（分為傷口中心 0-2mm、傷口邊緣 2-4mm、近端 4-6mm 及遠端 6-8mm）。
經流式細胞儀分選出 CD45+（免疫細胞）與 CD45-（非免疫細胞）後進行 10x Genomics 單細胞定序。
表達規律：無論是在全細胞群或特定內皮細胞群中，Mt1 與 Mt2 的表達量皆從未受傷狀態開始逐漸升高。
高峰期：在發炎階段（Inflammatory phase，即受傷後第 3 天）達到最高峰，隨後在增生期（Proliferative phase，第 7 天）開始下降，並於癒合後期（Resolution phase，第 14 天）回復至生理基準值。
這項時空動態特徵強烈暗示，Mt1 與 Mt2 在傷口早期血管新生與抗發炎反應中扮演著不可或缺的關鍵角色。
金屬硫蛋白維持血管完整性與對抗凋亡的機制
1. 作用機制模型
金屬硫蛋白（MT）作為細胞內重要的抗氧化劑與重金屬解毒蛋白，主要透過結合鋅離子（ Zn2+）來清除細胞內的活性氧（ROS）。
當內皮細胞缺乏 MT 時：施加外源性 VEGF 會異常誘導過量的 ROS 產生。在缺乏 MT 清除 ROS 的情況下，高氧化壓力會直接引發血管內皮細胞凋亡（Apoptosis），並嚴重損害血管新生作用。
當 MT 充足時：MT 能有效清除 VEGF 刺激下產生的過量 ROS，穩定細胞內氧化還原平衡（Redox homeostasis），進而維持內皮細胞的存活與血管成熟。
Slides 延伸補充：體外（In Vitro）高糖環境與 ROS 驗證 研究團隊在小鼠原代內皮細胞（MPECs）中進行實驗（Slide 14）： - 在高糖（Hyperglycemic）條件下，特異性敲低 *Mt1* 與 *Mt2* 會顯著增加細胞內的 ROS 累積。 - 相反地，超表達 MT 能夠維持超氧化物歧化酶 1（SOD1）的表達。SOD1 是維持內皮細胞氧化還原穩態的重要酵素。MT 透過穩定 SOD1 的表达，從而保護細胞免受氧化應激損傷。2. 後肢缺血小鼠模型（Hindlimb Ischemia Model）中的功能驗證
為了評估內皮細胞 MT 缺失對 VEGF 療法的影響，研究團隊採用了 C57BL/6 小鼠後肢缺血模型，並利用組織奈米轉染技術（Tissue Nanotransfection, TNT 2.0，給予 100V、10ms 脈衝電壓）在局部進行基因遞送：
實驗分組：
空載質體 + 對照 shRNA（Empty vector + ct shRNA）
VEGF ORFs + 對照 shRNA（VEGF ORFs + ct shRNA）
VEGF ORFs + 聯合敲低 MT1E 與 MT2A 的 shRNA（VEGF ORFs + shRNA MT1E+MT2A）
血流灌注測定：雷射多普勒血流灌注成像顯示，在第 14 天時，單純給予 VEGF 顯著改善了後肢的血流灌注。然而，一旦同時敲低內皮細胞的 MT，即使補給 VEGF，血流灌注恢復率依然顯著受損。
組織學免疫螢光染色：分析 CD31（內皮細胞標誌）與 SMA（平滑肌肌動蛋白，血管成熟標誌）的共定位係數（Pearson's co-localization coefficient）。結果證實，敲低 MT 會顯著降低 CD31/SMA 的共定位，顯示新生血管的結構完整性與成熟度大幅降低。
3. 多光子活體顯微鏡（Intravital Microscopy）觀察血管滲漏性
為了確認血管功能完整性，研究人員在非糖尿病傷口模型（第 7 天傷口邊緣）中進行了活體成像，分別靜脈注射不同分子量的螢光右旋糖酐（Dextran）：
對照組（Scrambled shRNA）：高分子量（2,000,000 MW，紅色）與低分子量（70,000 MW，綠色）右旋糖酐均完美限制在血管腔內，未見滲漏。
MT 敲低組（shRNA Mt1+Mt2）：顯現出嚴重的血管滲漏現象，低分子量的右旋糖酐大量滲透至血管外組織（組織間質螢光強度顯著升高，p < 0.05）。
這項活體功能性數據有力地證實了：缺乏金屬硫蛋白會導致新生血管功能不全且極易滲漏（Leaky vessels）。
聯合基因療法修復糖尿病壓力性潰瘍
基於體外與小鼠缺血模型的發現，研究團隊在糖尿病 db/db 小鼠上建立起糖尿病壓力性潰瘍（Diabetic Pressure Ulcer）模型，以模擬臨床最難癒合的缺血再灌流損傷傷口：
模型建立：利用磁鐵夾持小鼠背部皮膚（共進行 5 個循環，每個循環包含 6 小時夾持缺血與 18 小時釋放再灌流），隨後在缺血區域中央建立一個 3mm 的軸向傷口（Axial wound）。
基因治療遞送：傷口邊緣局部使用 TNT 2.0 技術遞送由內皮特異性啟動子 CDH5 驅動的 Mt1/Mt2 ORF 以及 VEGF ORF。
治療效果評估：
血流灌注（Perfusion）：第 10 天的雷射斑點對比成像（Laser speckle imaging）顯示，與對照組（Sham）相比，單獨遞送 VEGF 僅能部分改善灌注；而聯合遞送 VEGF 與 Mt1/Mt2 ORF 的組別，其血流灌注恢復效果最為顯著，血管新生與成熟度大增。
DNA 損傷指標（γ-H2AX 免疫染色）：在糖尿病微環境下，單獨給予高劑量 VEGF 實際上會因為引發氧化壓力而加劇血管內皮細胞的 DNA 損傷。然而，當聯合導入金屬硫蛋白（MT）後，內皮細胞中的 γ-H2AX 陽性染色顯著減少。這證實了 MT 的強大抗氧化作用，確實保護了血管內皮細胞免受 VEGF 伴隨產生的 ROS 毒害與 DNA 雙股斷裂損傷。
現場問答精選（Q&A）
問題一（主持人 Sasha Roy 教授）： 在傷口癒合的文獻中，我們知道金屬硫蛋白（MT）本身就具備促進血管新生的能力，而 VEGF 單獨使用也能促進血管新生（儘管形成的血管容易滲漏）。那麼，為什麼一定要採用「聯合療法（Combination therapy）」？為什麼不單獨使用其中一種？
答覆（Parul Katiyar 博士）： 這是一個非常關鍵的問題。首先，VEGF 治療的一大限制是它的半衰期極短，且在臨床高濃度給藥時，VEGF 會在內皮細胞內引發高水平的活性氧（ROS）堆積，這對細胞是有毒性的，會導致內皮細胞凋亡和脆弱、滲漏的血管生成。 而金屬硫蛋白（MT）作為一個極佳的輔助因子，主要作用就是清除 VEGF 刺激所產生的過量 ROS。當我們將兩者結合時，MT 能作為保護盾，消除 VEGF 帶來的氧化毒性副反應，從而使 VEGF 能安全且有效地促進功能健全、結構穩定（不滲漏）的成熟血管新生。因此，兩者結合能達到單藥治療無法企及的協同效應。
問題二（主持人 Sasha Roy 教授）： 這種聯合基因療法在未來的臨床轉化中，有沒有哪些潛在的局限性或需要特別審慎對待的地方？
答覆（Parul Katiyar 博士）： 在非糖尿病（生理）條件下，單一因子的作用可能就足夠；然而，糖尿病微環境極其複雜，充斥著持續的高血糖、嚴重的發炎反應與多重代謝紊亂。在這種複雜背景下，任何單一靶點的干預都容易受到其他病理通路的拮抗。 雖然聯合基因療法在小鼠模型中展現了極佳的療效，但其局限性在於糖尿病患者個體間的異質性很大。我們必須非常仔細地評估及優化每一個參數（如基因遞送的精確計量、轉染的時間窗口等），以確保其在人體高度複雜的代謝環境中仍能精準發揮作用。
問題三（現場聽眾）： 這項研究目前僅在小鼠與大鼠（Mice and rats）模型中完成，是否有任何人類臨床數據或臨床試驗計劃？
答覆（Parul Katiyar 博士）： 我們目前的研究靶點發現（scRNA-seq）與臨床前療效驗證，是以人類患者皮膚切片、人類內皮細胞以及小鼠壓力性潰瘍模型為主。目前所有的功能性與機制性數據均已在小鼠模型中穩健確立。我們現在正積極與合作者討論臨床轉化的可行方案，期望能儘快推向臨床階段。
Take-home Summary
糖尿病內皮細胞的 VEGF 阻抗性（VEGF Resistance）本質：單細胞轉錄組數據顯示，糖尿病患者內皮細胞的經典 VEGF 配體與受體表達量並未顯著降低，而是其下游起保護與平衡作用的金屬硫蛋白（MT1E/MT2A）發生了顯著的基因沉默（Gene silencing）。
VEGF 療法的雙刃劍效應：在缺乏金屬硫蛋白（MT）的糖尿病缺血組織中，外源性給予 VEGF 會異常激發氧化壓力（ROS 堆積），導致內皮細胞 DNA 損傷與凋亡，並形成不成熟、高滲漏性的病理性血管。
「VEGF + MT」二合一聯合基因療法：透過 TNT 2.0 奈米轉染局部導入外源性 MT 與 VEGF，MT 能有效清除 ROS、穩定 SOD1 的表達並維持細胞氧化還原穩態，從而保護內皮細胞免受 DNA 損傷，使 VEGF 能夠順利引導出結構完整、具備正常灌注功能的成熟血管網。這為臨床上頑固的糖尿病足潰瘍與壓力性尿道/皮膚潰瘍提供了全新且深具前景的精準治療策略。