N-104：次世代雙重作用的免疫調節與再生治療，用於第 1 型糖尿病

利益揭露與研究主軸：同時處理自體免疫與 β 細胞再生

Kenneth L. Brayman, MD, PhD, FACS 在開場先說明本演講相關利益揭露：他與團隊成立了 IsletRegen, LLC，本人為共同創辦人與 Chief Scientific Officer，因此接下來展示的資料與該研究開發方向相關。其揭露亦包括 IsletRegen, LLC 的股權／股東身分、員工／其他角色，以及 Manning Family Foundation 的研究支持；其職銜為 UVA Health / University of Virginia School of Medicine 之 Surgery、Medicine 與 Biomedical Engineering 教授。

本場重點是介紹團隊正在開發的一個類似物 N-104。N-104 的特色在於它是一個 dual-action peptide：一方面具有 免疫調節（immunoregulatory）作用，另一方面也具有 再生（regenerative）潛力。這在自體免疫疾病，特別是第 1 型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）中非常有吸引力，因為治療目標不只是壓低或阻止自體免疫，也希望能夠使已受損的組織、尤其是胰島 β 細胞（β cells）恢復或再生。

第 1 型糖尿病的未滿足需求：目前療法多能延緩或控制免疫，卻缺少再生能力

從最基礎的層次來看，第 1 型糖尿病的發生似乎始於某種「傷害」或「刺激」（insult），導致 β 細胞穩態喪失，並伴隨 HLA molecules 上調。接著，許多免疫事件被啟動，最終形成針對 β 細胞的免疫攻擊。這個初始刺激究竟是病毒感染、某種預先設定的遺傳程式，或其他尚未明確定義的因素，目前仍未完全釐清。不過，對整體病理機制的理解已經越來越精細。

T1D 的概念架構可整理為：β 細胞受到 insult 後出現 HLA expression 上升與 β-cell homeostasis 喪失；胰臟引流區域的 macrophages 攜帶 self-antigens，進一步在 lymph node 中教育 TCF7^hi cells；TCF7^hi CD8⁺ cells 可分化為短命的 TCF7^lo cytotoxic T cells，參與 β 細胞破壞。

Brayman 對當天稍早關於 anti-CD3 以及 humanized polyclonal 相關策略的資料表示鼓舞，因為這些都是朝向控制自體免疫的正確方向。然而，這些策略的限制在於：就他所知，它們並不具備再生 β 細胞的能力。

目前 T1D 相關治療或開發方向可分為幾類：β-cell regeneration 仍多在 preclinical 階段；stem-cell–derived β cells 已進入 trials；islet transplantation 已是 clinical approach；anti-CD3 也已進入 clinical 使用或評估。其共同限制包括：胰島移植常需要 life-long immunosuppression、可用胰島來源非常有限；anti-CD3 可延緩發病，但 β 細胞仍可能隨時間逐步被破壞。

因此，N-104 的概念價值在於：如果一個分子能同時 降低免疫破壞、又 促進 β 細胞功能與再生，它就可能填補目前 T1D 治療中相當重要的缺口。

N-104 與 lacritin 家族：從淚液蛋白到 β 細胞受體的意外連結

N-104 屬於 lacritin family。Lacritin 是一種自然存在的人類蛋白，最初是在淚液（tears）中被辨識出來；它已知可支持上皮健康與再生，並具有 pro-survival 與 pro-secretory 效果。

Brayman 回顧團隊進入糖尿病領域研究 lacritin 的過程相當偶然：一位長期研究 lacritin 的合作者因主實驗室整修，暫時搬到他們的實驗室附近。有一天，這位合作者走進來詢問是否有興趣一起研究 lacritin 在糖尿病中的角色，因為他們已在 β 細胞上找到 lacritin 的受體。團隊於是開始合作，後續多年研究顯示，lacritin 的活性區域主要位於 C-terminal domain。

目前團隊正開發並測試接近 500 種 lacritin 類似物（analogs），以找出活性最強、最適合作為治療候選物的版本。本場演講聚焦其中一個類似物：N-104。投影片標題將 N-104 定義為「Next-Gen Dual-Action Immunoregulatory and Regenerative Therapy for Type 1 Diabetes」，強調它不是單純免疫抑制，也不是單純再生刺激，而是雙重治療平台。

可能作用機轉：PKCα–AKT–FOXO、mTOR、NFAT 與受壓 β 細胞的存活訊號

N-104 的作用機轉是依據已知的 lacritin signaling 推論與實驗支持而來。Brayman 先描述第一條可能路徑：lacritin 可促進 FOXO 從細胞核轉位到細胞質。此過程與 PKCα（protein kinase C alpha） 活化有關；PKCα 會磷酸化並活化 AKT，而活化後的 AKT 可進入細胞核，磷酸化 FOXO1，使 FOXO1 轉位到細胞質。

這點在 β 細胞中特別重要，因為 FOXO1 可抑制轉錄因子 PDX1；PDX1 則與 β 細胞分化、身份維持及功能密切相關。同時，calcineurin 的表現也被認為是 β 細胞分化與增殖所需的關鍵要素。Brayman 強調，這些分子細節雖然技術性很高，但對理解 N-104 的 mechanism of action 十分重要。

第二條可能路徑涉及 mTOR pathway。N-104 可活化 PKCα，PKCα 進一步刺激 phospholipase D（PLD），生成 phosphatidic acid（PA）；PA 是已知的 mTOR signaling activator。透過這一路徑，β 細胞可能在 NFAT-mediated release of cell cycle restraints 的背景下進入增殖狀態，並伴隨較強的代謝活化。

此外，lacritin 似乎能協調與再生相關的訊號，並與 mitochondrial stabilization 有關；這在發炎壓力（inflammatory stress）下尤其重要。團隊認為，N-104 的治療潛力可能與「穩定並改善受壓 β 細胞狀態」密切相關。

N-104 的 putative mechanism 可整理為：N-104 與 β 細胞上的 receptor complex 結合後，透過 G protein、PKCα、AKT、FOXO1/FOXO3、PP2A、PLD、PA 與 mTOR 等節點，導向兩個主要結果：一是促進 β-cell proliferation；二是在 stressed β cells 中促進 autophagy 與細胞壓力調適。

Lacritin 存在於人體血液中，且 T1D 可能伴隨活性 monomer 下降

團隊接著想確認 lacritin 是否不只存在於淚液，也能在人體血液中被偵測到。結果顯示，lacritin 可在 human blood / plasma 中被偵測，而且可以分辨出 monomer 與 polymer 形式。

血漿分析以 anti-lacritin C-terminal 抗體偵測，並包含 secondary alone 對照；結果可見 lacritin polymer 與 monomer bands。圖中將 monomer 標示為 active form，polymer 標示為 inactive form，支持後續以 monomer 變化作為功能相關 readout 的概念。

進一步比較 T1D 患者與非糖尿病者後，團隊發現 T1D 患者的循環 lacritin 水準較低。這一點很有意思，因為過去並未顯示 lacritin 與 T1D 之間存在這樣的關聯。團隊目前也在擴大研究規模，納入更多糖尿病患者與對照者。

同時，無論是糖尿病或非糖尿病族群，lacritin 水準都會隨年齡增加而下降。這使得 lacritin 可能不只是與 T1D 相關，也可能反映一種與年齡、組織修復能力或 β 細胞壓力有關的缺乏狀態。

定量結果以 normalized LI-COR signals 呈現：healthy controls 的 lacritin monomer signal 高於 T1D，差異達顯著水準（圖中以表示）。年齡分層分析中，healthy group 的線性趨勢約為 y = −34.618x + 653.99，R² = 0.5591；T1D group 約為 y = −36.239x + 504.92，R² = 0.9083，顯示兩組皆隨年齡下降，但 T1D 整體位階較低。

N-104 改善 glucose-stimulated insulin secretion、胰島存活與 β 細胞增殖

在功能層面，團隊研究 lacritin / N-104 對 glucose-stimulated insulin secretion（GSIS） 的影響。由於 peptide 類分子可能需要延長體內停留時間，團隊也測試了 PEGylated formulation，也就是透過 PEGylation 增加分子穩定性與持續作用時間。

結果顯示，在體外實驗中，N-104 可顯著改善 insulin secretion，相較對照組有更好的葡萄糖刺激胰島素分泌反應。PEGylated 版本同樣與改善胰島功能有關，並且與較佳的 islet viability 相關。

當團隊觀察到 GSIS 改善後，下一個問題是：為什麼會改善？基於過去在眼部研究中已知 lacritin 可活化 NFAT 與 mTOR-related signaling pathways，團隊推測 N-104 可能不只是提高分泌功能，也促進 β 細胞增殖。為了驗證這一點，他們使用 CyTOF analysis（mass cytometry） 檢測多種 biomarkers，其中包括增殖標記 Ki-67。結果顯示 β 細胞族群中出現清楚的增殖增加。

這些資料使 N-104 越來越引人注意：它不只是潛在的免疫調節分子，也可能直接改善 β 細胞功能並促進 β 細胞增殖。

在模擬 T1D 發炎環境的人類胰臟切片中：N-104 增加 insulin / Ki-67，並降低 HLA-I 上調

團隊進一步詢問一個更接近 T1D 病理情境的問題：N-104 是否在發炎環境中仍然有效？ 這很關鍵，因為 T1D 的 β 細胞並不是處在正常培養條件下，而是處於免疫攻擊、HLA 上調與發炎壓力中。

因此，團隊與邁阿密的合作團隊使用 human pancreatic slices（HPS） 進行實驗。結果相當顯著：在這些條件下，N-104 仍能增加 insulin-positive 與 Ki-67-positive cells，同時降低 HLA class I upregulation。HLA class I 上調是 insulitis 與 β cell-related inflammation 的典型特徵之一，因此其下降支持 N-104 具有免疫調節或抗發炎效果。

HPS 實驗以 DAPI、Ki-67、HLA-Class I 與 insulin 進行影像分析：DAPI 為藍色、Ki-67 為灰色、HLA-Class I 為綠色、insulin 為紅色。相較 N-80/C-25 對照，N-104 在 insulin / Ki-67 相關 readouts 上呈正向 log2 fold-change，而 HLA 與 HLA+insulin 相關 readouts 則下降；圖中可見約 +2.82、+4.47、+3.56 等增幅，以及約 −0.91、−1.92、−3.00 等下降訊號，支持「促進 β 細胞增殖」與「抑制發炎性 HLA-I 上調」同時發生。

胰島移植模型：N-104 改善人類胰島移植後的血糖控制與移植物結果

接著，團隊把 N-104 應用到移植模型中。他們使用新鮮分離的人類胰島，移植到免疫缺陷的 NOD-SCID mice 中。結果顯示，若在人類胰島移植前進行 N-104 pre-incubation，或在受體動物中進行 N-104 治療，都能改善移植結果。

Brayman 表示，N-104 以及 PEGylated N-104 的資料均支持：此類分子可改善胰島再生環境、提升胰島移植 outcomes。這一點對於胰島移植尤其重要，因為臨床胰島移植受限於供體來源稀少、移植物功能衰退以及免疫環境等問題。

移植實驗流程包括：由人類胰臟分離 islets，進行 xenographic human islet transplantation 至小鼠模型；比較 untreated human islets、N-104 / PEG-N-104 處理組，以及 N-80/C-25 / PEG-N-80/C-25 對照組。血糖曲線追蹤至移植後約 60 天以上，並以 nephrectomy 驗證血糖控制依賴移植胰島功能。整體 take-home message 是：N-104 enhances the outcomes of human islets transplant。

NOD 小鼠預防實驗：PEG-N-104 可預防自體免疫糖尿病，且停藥後效果持續

由於 T1D 是自體免疫疾病，而 lacritin / N-104 似乎能下調自體免疫活性，團隊進一步在 NOD mouse 中測試。NOD mouse 是常用的自體免疫第 1 型糖尿病多基因模型。

在預防性研究中，結果非常突出：PEGylated N-104 可預防自體免疫糖尿病發生。更重要的是，即使停止給藥，動物仍基本維持非糖尿病狀態。這表示 N-104 可能不只是短暫壓低血糖或暫時抑制發炎，而是可能改變疾病進程。

NOD mouse staging 可概念化為：pre-stages 約 0–4 週、stage 1 約 5–9 週、stage 2 約 10–14 週、stage 3 約 15 週以上。預防實驗在約 9 週齡開始給予 PEG-N-104，並與 PEG-N-80/C-25、saline only 與 no treatment 對照比較；給藥方案為每週 3 次、共 8 週，之後追蹤至約 40 週。PEG-N-104 組在停藥後仍維持保護效果，圖中標示至第 40 週僅約 1/10 發展為糖尿病。

NOD 小鼠逆轉實驗：已進入 stage 3 後，仍有 50% 可恢復正常血糖

沿著 T1D 分期治療的討論，團隊也在已經進入 stage 3、也就是已出現糖尿病的 NOD mice 中進行治療。這部分資料同樣令人印象深刻：短期 PEG-N-104 治療後，約一半小鼠恢復正常血糖。

Brayman 特別指出，在 30 隻小鼠中，有一半重新達到 normal glycemia；其中 8/30 隻小鼠 在短期治療後能維持長期正常血糖。這在已發病模型中尤其重要，因為它暗示 N-104 不只是預防發病，還可能在一定程度上 rescue / reverse 已發生的糖尿病表現。

逆轉實驗中，NOD mice 在糖尿病發生後接受 systemic PEG-N-104 injection，並與 PEG-N-80/C-25 對照；給藥同樣為每週 3 次、共 8 週。結果顯示 15/30 mice regained normoglycemia，其中 8 mice maintained regained normoglycemia。此處的 take-home message 是：PEG-N-104 injection reverses T1D in 50% NOD mouse。

組織學證據：PEG-N-104 降低 insulitis、保留胰島結構與 β 細胞量

組織學分析顯示，單獨使用 N-104 / PEG-N-104，即可顯著降低免疫細胞浸潤。這點非常重要，因為 insulitis 是 T1D β 細胞破壞的核心病理過程之一。Brayman 強調，這些變化不是合併其他治療後的結果，而是 N-104 本身帶來的效果。

insulitis severity 以 score 0–3 評估；PEG-N-104 組的平均 insulitis score 約 1.16，明顯低於 PEG-N-80/C-25 組約 2.66 以及 saline 組約 2.71，差異達高度顯著（）。胰島分布也顯示 PEG-N-104 組有較多低分數、較少重度浸潤胰島。此結果支持 PEG-N-104 significantly reduces insulitis severity and preserves islet integrity。

進一步的免疫組織化學與影像分析也顯示，N-104 injection 可保護 β cell mass。多種胰島內分泌細胞與 β 細胞標記在 PEG-N-104 組中被保留，顯示胰島結構與組成受到保護。

胰島組成分析包括 glucagon（α cells）、insulin（β cells）、NKX6.1（β-cell marker）、proinsulin（β-cell biosynthetic marker）與 SST / somatostatin（δ cells）。相較 PEG-N-80/C-25，PEG-N-104 組保留較完整的 endocrine islet composition，支持「Injection of PEG-N-104 protects β cell mass in the islets」。

同時，N-104 不只在組織層級保護 β 細胞，也在免疫細胞層級調節免疫反應。Brayman 提到，所謂 TCF7-high T cells 在接受 lacritin / N-104 後出現有利變化，這與前面提到的 TCF7^hi CD8⁺ cells 參與自體免疫分化路徑相呼應。

免疫細胞活性分析涵蓋 CD80、F4/80 macrophages、CD56 NK cells、MPO neutrophils、CD206 M2 macrophages 與 CD3e T cells 等標記；PEG-N-104 組呈現免疫細胞活動受抑制或被調節的型態，支持「PEG-N-104 injection suppresses and regulates immune cell activities in NOD mouse」。

平台意義與未來方向：從 T1D 延伸到 T2D 的 β 細胞失敗

Brayman 在總結時強調，N-104 可在 in vitro 與 in vivo 情境下促進胰島功能與存活。PEGylated N-104 在 NOD mouse 中可延緩、預防，甚至在部分已發病動物中 rescue / reverse T1D。團隊也正在開發其他 lacritin analogs，希望找出能更強力促進 β 細胞再生、並同時下調自體免疫的候選分子。

目前最初的治療焦點當然是 第 1 型糖尿病，因為 T1D 同時具有免疫破壞與 β 細胞缺失兩大問題，而 N-104 的雙重作用正好對應這兩個需求。不過，Brayman 也指出，這個策略未來可能對 第 2 型糖尿病（type 2 diabetes, T2D） 產生重大影響。T2D 的後期同樣會出現 β 細胞功能衰竭，而其確切機制仍有許多未解之處。如果能以間歇性治療方式促進 T2D 胰島再生或恢復功能，對於正在發展 insulin resistance、hyperglycemia 以及後續 β 細胞耗竭的患者，可能會帶來很大的治療改善。

最後，因時間限制現場未開放問答，但這場演講的核心訊息非常明確：N-104 代表一種將免疫調節與 β 細胞再生結合的新策略，可能使 T1D 治療從單純延緩免疫破壞，走向同時修復胰島功能的方向。

Take-home Summary

N-104 是 lacritin 家族的 next-generation analog，設計目標是同時具備 immunoregulatory 與 regenerative 作用。
T1D 的核心未滿足需求是：現有免疫療法可延緩或調控自體免疫，但多數缺乏真正促進 β 細胞再生的能力。
N-104 的可能機轉包括 PKCα–AKT–FOXO1 / FOXO3 axis、PLD–phosphatidic acid–mTOR signaling、NFAT-related cell cycle regulation，以及受壓 β 細胞中的 autophagy / mitochondrial stabilization。
Lacritin 可在人體血液中被偵測到，且 T1D 患者循環 lacritin monomer 低於健康對照；lacritin 水準也隨年齡下降。
N-104 在體外可改善 glucose-stimulated insulin secretion、胰島 viability 與 β 細胞 proliferation。
在 human pancreatic slices 的 T1D-like inflammatory environment 中，N-104 增加 insulin / Ki-67 相關訊號，並降低 HLA class I upregulation。
在人類胰島移植到 NOD-SCID mice 的模型中，N-104 / PEG-N-104 改善移植結果與血糖控制。
在 NOD mouse 中，PEG-N-104 可預防糖尿病發生，且停藥後保護效果仍持續；在已發病 stage 3 模型中，約 50% 小鼠恢復正常血糖，8/30 長期維持。
組織學資料顯示 PEG-N-104 降低 insulitis、保留胰島完整性與 β cell mass，並調節多種免疫細胞活動。
雖然初始應用鎖定 T1D，此平台未來也可能延伸至 T2D，特別是針對 β 細胞衰竭與胰島功能恢復的治療策略。