樹突細胞治療第一型糖尿病：免疫耐受、臨床前證據與臨床試驗進展

……如果在 β 細胞中產生足夠的壓力來觸發疾病的起始，那麼我認為這就是一個勝利。因為生產疫苗雖然昂貴，但它帶來的益處遠不止於預防第一型糖尿病，它還能廣泛預防病毒感染。所以我認為這是一個雙贏的局面，我們必須去嘗試。如果我們能預防一小部分病例，我也會很高興。我同意你的觀點，我不認為它能百分之百預防疾病，但如果結果出乎意料，我也會很樂見。

非常感謝。我想我們必須繼續下一個議程了。

接下來的演講將由 Jason Gaglia 發表，主題是用於治療第一型糖尿病的樹突細胞 (Dendritic Cell for Treatment of Type 1 Diabetes)。

樹突細胞與免疫耐受性的基礎科學

謝謝大家，也感謝主辦單位邀請我來這裡，並感謝所有留到最後的與會者。這場演講將與你們在這次會議上看到的其他內容有所不同。我們將從一些基礎科學開始，然後進入目前樹突細胞療法的臨床進展。

首先，為了建立整個框架，我們需要了解耐受性 (tolerance) 是如何運作的，以及樹突細胞 (dendritic cells, DCs) 在耐受性中扮演的角色。

基本上，在我們的身體裡有胸腺。胸腺是 T 細胞進行正向選擇與負向選擇的地方。原則上，自體反應性 (autoreactive) T 細胞應該被負向選擇淘汰，所以它們不應該逃離胸腺。不幸的是，這個過程並非百分之百完美。因此，我們有一些 T 細胞會逃離胸腺進入身體，而它們可能前往的地方之一就是胰臟引流淋巴結 (draining pancreatic lymph node)。

在那裡，我們還有另一次機會，因為引流淋巴結中的樹突細胞可以幫助再次教育這些 T 細胞。如果它們具有自體反應性，樹突細胞可以導致它們缺失 (deletion)、失能 (anergy)，或者將它們推向調節性表型 (regulatory phenotype)。如果這個機制也失敗了，當這些 T 細胞到達胰臟時，它們就會開始攻擊。

因此，如果我們能利用這些樹突細胞就太好了。正如你們之前聽說的，它們是先天免疫系統的一部分，但它們確實深刻影響著適應性免疫系統。我們的主要目標是：我們能否將其轉化為預防疾病的手段？

樹突細胞療法的優勢

進一步思考樹突細胞，它們其實是非常適合用來操作的細胞。

樹突細胞實際上可以從循環中的單核球 (monocytes) 製造出來，而且利用現有的技術，獲取循環單核球非常容易。我們只需要進行白血球分離術 (leukapheresis)，就能獲得大量的單核球。然後，你可以用簡單的細胞激素 (cytokine) 處理一週，將這些單核球成熟為樹突細胞。只要加入 GM-CSF 和 IL-4，你就能得到樹突細胞。這些是未成熟的樹突細胞 (immature dendritic cells)，它們本身就傾向於具有致耐受性 (tolerogenic)。 此類細胞的特徵是 CD40 以及 T 細胞共刺激分子 CD80 和 CD86 的表現量較低。

因此，製造這種細胞療法的生產成本遠低於其他細胞療法。它不需要基因重組，不需要長期培養，而且相對安全且容易生成。

這些細胞的另一個優點是，你可以將它們注射到幾乎任何地方，它們都會到達需要去的地方。你可以進行皮下注射、皮內注射或靜脈注射——我們稍後會看到所有這些不同途徑的數據。它們會進入次級淋巴器官，去執行它們需要做的工作。

它們需要做的工作就是產生耐受性，這可以透過缺失、失能或誘導各種類型的調節性 T 細胞 (Tregs) 來實現。這不僅包括經典的 CD4 FoxP3 陽性 Tregs，還包括 Tr1 細胞，甚至 CD8 Tregs，都可以由樹突細胞生成。

免疫生成性與致耐受性樹突細胞的差異

在這個過程中，樹突細胞也可以經歷成熟過程。因此，它們可以變成免疫生成性 (immunogenic)，而不是致耐受性，這個途徑以前也被利用過。

如果我們這樣想：這些樹突細胞如果是未成熟或部分成熟的，它們就是致耐受性的；但如果它們完全成熟，特別是在細菌感染或其他抗原刺激的情況下，它們就會變成免疫生成性。事實上，在美國有一種獲批的療法（以前在歐洲也獲批過，儘管後來因商業原因撤回），就是使用免疫生成性樹突細胞療法來治療前列腺癌。基本上，你載入胜肽，進行適當處理，它就具有免疫生成性。

但硬幣的另一面是，你擁有致耐受性的樹突細胞，如果你能將其狀態「鎖定」，你可以透過 維生素 D (vitamin D)、地塞米松 (dexamethasone) 或 雷帕黴素 (rapamycin) 等處理來實現。這樣你就能擁有致耐受性樹突細胞，並讓它製造致耐受性細胞激素（如 IL-10 或 TGF-β），從而再次實現失能與缺失。

應用於第一型糖尿病的臨床前數據

那麼，如何將這應用於第一型糖尿病呢？

我們知道第一型糖尿病是一種自體免疫疾病。我們知道 T 細胞是第一型糖尿病的主要參與者，而且我們知道它們會辨識特定的 β 細胞抗原，特別是前胰島素原 (preproinsulin) 和 GAD。這方面有很多數據支持。我們也知道，在第一型糖尿病的 NOD 小鼠模型和第一型糖尿病患者中，樹突細胞表現出改變的活化表型，這種表型傾向於效應反應 (effectors) 而非調節反應 (regulation)。

因此，如果我們能在致耐受性樹突細胞上遞送 β 細胞抗原，我們或許就能刪除或使這些致病性 T 細胞失能，並擴增抗原特異性 Tregs，從而對這些抗原產生全面的免疫抑制。如果你載入前胰島素原，你可能可以針對前胰島素原；透過表位擴展 (epitope spreading) 以及處於正確的局部環境中，你也可能可以針對 GAD。

讓我們來看看背後的一些數據。

首先是 Clare-Salzler 及其同事的研究 (1992年)。基本上，他們從引流胰臟淋巴結中取出樹突細胞，並將它們放入 NOD 小鼠體內。在圖表中，如果你從胰臟淋巴結取出樹突細胞，並將其放入注定會發病的小鼠體內，這些小鼠就沒有發病。但是，如果你從身體其他淋巴結或脾臟等其他地方取出樹突細胞（這是圖表上的其他線條），它就沒有效。所以，只有來自引流胰臟淋巴結的樹突細胞才有效，這很合理，因為那些是從胰臟獲取抗原的細胞，它們自然應該發揮致耐受作用。

但是，如果我必須到處從人體取出胰臟引流淋巴結，那將會非常困難，我不認為我能治療很多人。因此，如果我們有更好的細胞來源會更好。

接著是 Feili-Hariri 團隊的研究 (2002年)。在小鼠模型中，由於很難進行白血球分離術，他們直接使用了骨髓細胞。但成熟的概念是一樣的：使用 GM-CSF 和 IL-4。然後，他們也將這些細胞放入糖尿病前期的 NOD 小鼠體內，他們要麼只放入樹突細胞，要麼放入載有胜肽的樹突細胞。

結果顯示，單獨的樹突細胞和載有胜肽的樹突細胞都具有致耐受性。如果你將胰臟切片並進行胰島炎評分 (insulitis score)，在這兩組中胰島炎都減少了，而載有致糖尿病胜肽的組別表現得更好。這很合理：DCs 是廣泛致耐受的，如果你在上面加上疾病特異性胜肽，它們的效果會更好。

臨床用致耐受性樹突細胞的工程化

那麼，我們將如何為臨床使用設計這些致耐受性 DCs？

細胞激素介質條件化 (Cytokine mediator conditioning)： 我們可以添加 IL-10、TGF-β、維生素 D（這很常用）、地塞米松和雷帕黴素，這些可以創造我們所謂的「半成熟致耐受性 DCs (semi-mature tolerogenic DCs)」。我們試圖將它們鎖定在這種致耐受表型中，以免它們變成免疫生成性 DCs。
基因操作 (Genetic manipulation)： 正如前面提到的，免疫生成性 DCs 有很多共刺激分子：CD80、CD86 (即 B7-1, B7-2)、CD40。如果你進行基因操作 (例如使用反義寡核苷酸, Antisense oligonucleotides) 使其不表現這些分子，你就能更穩定地鎖定在致耐受途徑中。
抗原載入 (Antigen loading)： 將感興趣的抗原放在這些細胞上是很合理的。載入抗原後，我們或許可以透過某些方式穩定它們。
穩定化 (Stabilization)： 其中一種方法是，不使用強烈的類鐸受體促效劑 (toll-like receptor agonist)，而是使用較溫和的類鐸受體促效劑 (例如 MPLA 或低劑量 LPS)，試圖將它們鎖定在這種半成熟狀態。

樹突細胞療法的臨床試驗進展

現在讓我們來看看目前已經完成的一些臨床試驗。我將列出我所知的所有臨床試驗。

1. 匹茲堡大學 (University of Pittsburgh) 與 DiaVacs

匹茲堡大學實際上是第一個在該領域發表論文的團隊。他們進行了一項隨機雙盲安慰劑對照試驗。規模相對較小，只有 10 個人，主要是為了評估安全性，因為監管機構限制了他們可以招募的對象。他們只能招募 18 到 60 歲的成年人，並且被要求招募患有長期第一型糖尿病的人。我認為監管機構可能擔心疾病會惡化，因為也許這些樹突細胞作為致耐受性並不穩定，可能會變成免疫生成性。所以他們要求在「不會造成太大傷害」的人身上進行測試。不幸的是，這使得展示療效變得非常困難。

他們提取了單核球，沒有進行任何胜肽載入。但他們確實針對共刺激分子 CD40、CD80 和 CD86 使用了反義寡核苷酸。然後，他們每兩週進行一次皮內注射，持續四週。結果顯示它是安全的。檢測到了一點點 C-胜肽 (C-peptide)，但因為這些人病史太長，你無法從中得出太多結論。不過，他們確實看到了 B 調節細胞群 (B regulatory population) (B220+ CD11c- CD19+ IL-10+) 的增加。從機制的角度來看，這是有道理的。

隨後成立了一家名為 DiaVacs 的衍生公司，他們計畫進行一項多中心、雙盲、安慰劑對照的交叉研究，包含 24 名受試者。因為有了早期的安全性數據，他們現在打算進入青少年群體，計畫招募 12 到 35 歲的患者。除此之外，方案非常相似。但我目前還沒有看到這項研究的任何臨床數據。

2. 萊頓大學 (Leiden University) 與希望之城 (City of Hope)

接下來是萊頓團隊所做的工作，包括在萊頓大學和希望之城醫學中心。這始於萊頓大學的一項開放標籤劑量遞增試驗，包含 9 名受試者。同樣因為監管原因，必須從 18 到 45 歲的成年人開始，且病史較長（8 個月或更久）。

因為他們選擇了特定的胜肽，他們將受試者限制在 HLA-DR4 陽性的人群，以便展示特定胜肽的效果，他們使用的是前胰島素原 C19-A3 (proinsulin C19-A3)。他們證明了這是可行且安全的，並且降低了對前胰島素原和 C-胜肽的自體免疫反應，我稍後會展示這些數據。

當一些研究人員轉移到希望之城時，他們也擴展了這項試驗。設計非常相似，但他們學到了一個教訓：當患者沒有 C-胜肽可供觀察時，很難證明任何效果。因此，在這裡他們要求受試者必須具有 C-胜肽，並將病史上限設定為 4 年。我目前還沒有看到這項研究的發表數據。

3. 白俄羅斯團隊

接下來是白俄羅斯團隊的數據。他們進行了一項開放標籤試驗，計畫招募 32 名成年受試者。在這裡，他們使用維生素 D3 來試圖將其鎖定為致耐受性，並與間質幹細胞 (mesenchymal stem cells) 以及他們所謂的「致敏胜肽 (primed peptides)」（我假設這是疾病特異性胜肽）進行共培養，然後注射到皮下空間。

不幸的是，我能找到的關於這項研究的唯一數據是 2023 年的一篇摘要，當時他們只展示了 4 個人的數據。他們表示這是安全的，並且他們非常初步的數據聲稱，與基線相比，這些人在混合餐耐受性測試 (mixed meal tolerance test) 後的 C-胜肽有所增加。但樣本數只有 4，很難解釋。

4. Evotris (Avotres) / 喬斯林糖尿病中心 (Joslin Diabetes Center) 試驗

最後是該領域進行過最大規模的研究，也就是我們在喬斯林糖尿病中心進行的 Evotris 試驗 (試驗藥物為 AVT001)。這是一項第一/二期隨機雙盲安慰劑對照研究，包含 25 名受試者（治療組 19 人，安慰劑組 6 人）。我們從 18 歲及以上開始，但鑑於研究的安全性，FDA 允許我們在試驗過程中將年齡下限擴大到 16 歲，且診斷時間需小於 1 年。

基本上，我們採集了白血球分離產物，提取單核球，用 GM-CSF 和 IL-4 處理約一週。它們被載入了 HSP60 訊號胜肽 (Hsp60 signal peptide)，這是第一型糖尿病中的一種抗原，也是出於我稍後會解釋的其他原因。

他們做的一件與眾不同的事是，他們實際上固定 (fixed) 了細胞，這樣胜肽就會留在那裡並持續呈現，而不會循環脫落。然後，它不是透過皮下或皮內注射，而是作為靜脈輸注 (intravenous infusion) 給予，每月一次，共三次。結果證明它是安全的，而且與安慰劑相比，C-胜肽的下降幅度較小。

萊頓大學研究結果細節

回頭看看萊頓大學的研究，你可以看到皮內注射的樣子。注射生理食鹽水時，你看不出什麼變化；但注射細胞時，你實際上會看到一些發紅和凸起。這會在幾個小時內消失，但確實有一些注射反應。

你沒有看到的是 A1c 的任何變化、胰島素使用量的任何變化，或 C-胜肽的任何變化。再次強調這項限制：這些都是患有長期第一型糖尿病的人，所以在免疫標靶療法中很難看到這些指標的變化。

然而，從免疫學方面來看，他們觀察到的是：對他們使用的胜肽 (C19-A3) 以及整體前胰島素原的干擾素 γ (interferon gamma) 減少，而 IL-10 增加。同時，對這兩者的增殖反應 (proliferative responses) 也降低了。

Evotris (AVT001) 研究機制與詳細結果

接下來轉向 Evotris 研究。這項研究利用了一個可能在座多數人都不熟悉的途徑，因為它是一個相對冷門的途徑，它使用了一種不同類型的 T 調節細胞。我們大多數人熟悉的是 CD4 FoxP3 Tregs，或許還有 Tr1 Tregs。但這是一個由幾個團隊描述過的 CD8 HLA-E 限制性 Treg 途徑 (CD8 HLA-E restricted Treg pathway)。

HLA-E 是第一類 HLA 分子之一，它是一個非經典的分子。一般來說，它呈現兩種類型的胜肽：要麼是來自其他 HLA 分子的訊號胜肽，要麼是其他訊號胜肽，例如來自前胰島素原的訊號胜肽和來自 Hsp60 的訊號胜肽——這兩種訊號胜肽在第一型糖尿病的環境中都能被辨識。

因此，這些自體樹突細胞按照我描述的方式進行處理，我們相信它們可以引起這些 CD8 HLA-E 限制性 Tregs 的成熟和上調。

受試者基線特徵

這項研究的受試者分組相對均衡。但這也顯示了我們所謂的「喬斯林詛咒 (curse of the Joslin)」：進入這項研究時，後來成為治療組的基線 A1c 為 6.0%，而安慰劑組為 5.7%。當你的 A1c 在進入試驗前就已經優於治療目標時，就很難證明 A1c 有所改善。

在受試者流程圖中，我們篩選了 32 人，隨機分配了 27 人。有幾個人在白血球分離術前撤回了同意。在這項研究中，我們對所有人進行了白血球分離術，包括安慰劑組的人，這樣你就不能聲稱「也許白血球分離術本身產生了某種作用」。然後我們對所有接受分離術的人給藥（安慰劑或細胞），並對他們進行了兩年的追蹤。我們之前發表了一年的數據，今天我將向你們展示長達兩年的數據。

Treg 分析與 C-胜肽結果

首先，該公司為其 CD8 HLA-E 限制性 Tregs 開發了一種專有的 Treg 分析方法。你可以看到，接受藥物治療的組別在抑制作用 (inhibition) 上有所增加，並且在整個兩年期間都具有統計學意義。而接受安慰劑的組別則沒有增加，事實上，隨著時間的推移，他們的情況惡化了，到兩年時變得明顯更差。

在 C-胜肽方面，這顯然很重要。在早期的時間點（第 150 天和第 360 天），C-胜肽存在統計學上的顯著差異。你需要記住，這是在治療的非常早期進行的，並且沒有給予加強劑 (boosters)，而且這些是固定的細胞。因此，治療效果似乎隨著時間的推移而減弱，大約在第 150 天左右或之後，但在一年時仍然顯著。到了兩年時，雖然存在差異，但不再具有統計學意義。

治療組和安慰劑組在血紅素 A1c 和胰島素使用量方面存在差異，但這些差異不具有統計學意義。

基線 C-胜肽分層分析

如果我們根據基線 C-胜肽進行分層，使用研究中 C-胜肽的中位數（混合餐耐受性測試的曲線下面積為 0.545 nmol/L），你可以看到組別出現了明確的分裂：

那些基線 C-胜肽較低的人，與安慰劑相比沒有任何反應；而那些一開始就具有穩健 C-胜肽的人，與安慰劑相比，C-胜肽得到了非常好的保存。因此，這種免疫療法似乎在殘餘 β 細胞質量較多的人群中效果更好。

如果我們進一步深入探討（這只是假設生成，因為研究的統計檢定力不足以得出確切結論），我們觀察第 150 天這個效果最大的早期時間點：基本上，年齡較輕且 C-胜肽含量最高的人，在這種治療中表現最好。

核心結論 (Take Home Messages)

今天的核心結論如下：

樹突細胞是一種極具潛力的療法。 它們可以很容易地從循環單核球中生成，並透過白血球分離術輕鬆收集，這是一種臨床上可接受且成本不高的程序。
目前已有多種方法可用於生成致耐受性樹突細胞。
載有糖尿病相關胜肽的樹突細胞已在幾項早期臨床試驗中安全使用，並在部分試驗中顯示出持久免疫偏離 (immune deviation) 的療效證據。
充足的基線 C-胜肽非常重要，這是證明樹突細胞療法能保存 C-胜肽的關鍵。

最後，我想感謝參與我所描述的喬斯林糖尿病中心臨床試驗的團隊。這是開發該技術的 Evotris (Avotres) 公司、為我們生成樹突細胞的丹娜-法伯癌症研究所 (Dana-Farber)，以及我在喬斯林的團隊之間的合作。當然，還要感謝所有研究參與者及其家人。謝謝大家。

Q&A 問答時間

問：你現在擁有的數據，也就是我們目前展示的數據，足以做出繼續這些研究的決定嗎？

答：有的，我們有興趣繼續推進 Evotris 產品，並利用它進行第三期研究，因為我認為這些數據非常有希望。我認為未來的發展方向可能是，你處於疾病的越早期，就越容易用致耐受性樹突細胞進行治療。所以我認為會有朝這個方向嘗試的趨勢。

問：那麼第二階段或第三階段的試驗，是計畫在第二期 (Stage 2) 第一型糖尿病患者中進行嗎？

答：我的希望是能夠進入 Stage 2 人群，但從後勤角度來看，這是一個很難進入的群體。但我認為治療這個群體是非常有意義的，我相信這種療法在那個階段會表現得非常好。如果你將這種療法的 C-胜肽保存效果與例如 teplizumab 進行比較，它實際上是非常有利的。唯一的例外是，就像 teplizumab 一樣，他們認為你可能需要施打加強劑 (booster)。在這裡，特別是如果你使用固定的細胞，你將必須施打加強劑。

問：如果你在 Stage 2 糖尿病患者中進行下一階段的研究，你會使用安慰劑對照 (placebo control) 還是 teplizumab 對照？

答：這是一個很難回答的問題。你知道，現在已經有了一種獲批的療法，要進行安慰劑對照試驗變得更加困難。然而，作為一名執業的內分泌科醫師，我非常清楚有許多患者不想要使用 teplizumab。如果在臨床試驗中強制要求接受試驗藥物或 teplizumab，可能會讓患者陷入兩難的境地。所以就我個人而言，即使 teplizumab 已經獲批，我仍然非常樂意提供安慰劑對照試驗，因為有足夠多的人不想要使用 teplizumab。

有沒有其他問題或評論？如果沒有，非常感謝大家。

（接下來將進行最後一場演講……）