幹細胞衍生胰島細胞用於細胞治療：進展、障礙與未來方向
非常感謝，很高興能來到這裡。我們直接進入正題。首先，我需要聲明一些可能影響我觀點的附屬關係：我是 Tolerance Bio 的科學共同創辦人與顧問、Sernova 的臨床諮詢委員會成員，以及 Guidepoint 與 Axxon Advisors 的顧問。
幹細胞衍生 β 細胞分化概述
這部分剛好接續在 Paola 精彩的演講之後。我們來看看幹細胞衍生 β 細胞（Stem Cell-Derived Beta Cells, sBC）的分化概述。我想提醒大家，這種定向分化（direct differentiation）的過程，實際上是在模擬器官在體內的發育。這個分化過程大約需要 23 天，階段包括：人類多能幹細胞（hPSC，第 0-3 天）→ 定型內胚層（Definitive Endoderm，第 4-5 天）→ 原始腸管（Primitive Gut Tube，第 6-9 天）→ 胰臟祖細胞（Pancreatic Progenitor，第 9-15 天）→ 內分泌細胞（Endocrine，第 16-23 天），最終形成 sBC。
當分化成功時，這就是我們所討論的成果。我們可以修飾我們的細胞（幹細胞）使其表現 GFP，這樣我們就能即時監測胰島素的表現。最終，我們會得到一個類似原代胰島（primary islets）的胰島結構。
這一切建立在許多基礎文獻之上。早期有許多實驗室做出了貢獻，包括 Viacyte、許多發育生物學家，接著是 Melton 和 Kieffer 實驗室，而我們實驗室則在稍後首次展示了如何在培養皿中功能性地生成產生胰島素的細胞。我們很榮幸能為此貢獻一份心力。我想說的是，這真的是一個團隊合作的成果，而且正如你們稍後會聽到的，我們的工作還沒有結束。
最初這個過程是什麼樣子呢？我們基本上就是拿一個懸浮培養盤，把它放進培養箱裡，這真的是非常「土法煉鋼」（MacGyver-ed）的做法。後來我們進階到立體培養（stereo cultures），到現在，甚至在我們實驗室裡，我們已經在使用高達 500 毫升的生物反應器（bioreactors）了。這聽起來很簡單，但請了解，擴展規模（upscaling）的每一個步驟本身都是一項挑戰。想像一下其中的氧氣供應問題。因此，對於每個想做這件事、想擴展規模並使其具備成本效益的人來說，這都是一項挑戰。
但我們知道，我們都對這個前景感到興奮。這些細胞已經進入臨床試驗並正在幫助病患，例如 2025 年發表在《新英格蘭醫學雜誌》（NEJM）的臨床試驗。現在甚至已經有第三期臨床試驗正在招募受試者。我真的不敢相信，因為當我在博士階段開始這段旅程時，我還覺得「這是科幻小說」，但現在它已經真實發生了。
製造挑戰與冷凍停靠點
現在，我們可以稍微肯定自己一下，但沿途有哪些地方是我們應該改進的？我想指出一些方面，強調這從頭到尾都是一個非常複雜的過程，而且再次強調，這需要團隊合作。
如各位所見，最初的幾個步驟通常只需要兩到三天，但接下來，當我們要從胰臟祖細胞或胰臟內胚層進入內分泌分化時，我們其實還不完全了解，也無法將這一步做得很好。這需要花費長達 23 到 30 天的時間，而其他研究方案甚至需要好幾週。當你進入 GMP（優良製造規範）階段時，如果你能把製造時間減少幾天（更不用說幾週），這對製造成本會產生非常實質的差異。
接著我們面臨的問題是，如何將這些成果提供給廣大的人群？當你在一個 3 公升的反應器中成功培養出大量細胞時，你要拿它們怎麼辦？我們需要停靠點（stopping points）。我們之前發表過一篇論文（其他團隊也有相關研究），現在我們已經可以在整個過程中設置停靠點。當我們獲得這些產生胰島素的細胞時，我們可以將它們冷凍保存。在我們最滿意的研究結果中，當我們解凍這些細胞時，它們的功能實際上提升了，而且不需要的細胞也被清除了。這給了我們極大的彈性。對我的實驗室來說，這非常方便，因為它提供了實驗上的彈性，你們在接下來的幾張投影片中就會明白我為什麼這麼說。
定義最佳的 β 細胞表型
那麼，β 細胞呢？對於體外模型（in vitro modeling）——也就是為了更了解這些細胞如何運作、自體免疫或同種異體排斥（allo rejection）如何發生——什麼才是最佳的 β 細胞表型（phenotype）？ 而理想的移植設定又是什麼？我們需要的是一個「運作得還行」的細胞，還是一個「非常卓越、高度分化」的細胞？
通常你可能會認為，β 細胞分化得越成熟，就越容易受到壓力影響。我展示了一些實驗室的數據：圖表中顯示了人類胰島素分泌量與時間的關係。我們首先將人類原代胰島暴露於丙酮酸（pyruvate）中，它們在這種情況下不應該有反應（你不會希望在運動時發生這種分泌）。接著經歷低葡萄糖和高葡萄糖環境，你可以看到第一階段分泌，然後在低葡萄糖下第二階段會關閉；當你用 KCl 使其去極化（depolarize）時，你會得到一個大致相似的反應，對我來說，這是一個功能性細胞反應的指標。
現在我們來看看第一代（Generation 1）的 sBC。它們看起來有點不成熟，沒有第一階段分泌，但可以被去極化。而在第二代（Generation 2）細胞中，它們看起來好多了，具備了第一階段分泌；第二階段雖然可能還有點疑問，但其分泌的差值（delta）與人類胰島非常具有可比性。
有趣的是，當你將這些細胞放入臨床前的 NOD 小鼠體內時，你會發現，那些在培養皿中功能不佳的細胞，現在在動物體內卻能發揮作用。 這讓我回想起移植外科醫生告訴我的話：在移植之前，你無法確知胰島移植的效果如何，你只能移植進去，然後從外部觀察結果。因此，我認為我們必須真正理解，為了實現有效的移植，我們到底需要生成什麼樣的理想細胞類型。
細胞治療的剩餘挑戰：缺血、移植位點與排斥
這引出了下一個問題：當我們進行移植時，我們能保護我們製造出來的這些細胞免受**缺血誘導的死亡（ischemia-induced death）**嗎？最佳的移植位點在哪裡？我們曾發表過關於減輕幹細胞衍生胰島素產生細胞移植後缺血性損傷的研究（Faleo et al., Stem Cell Reports）。
從實驗數據來看，當我們使用小鼠腎包膜（kidney capsule）或皮下（subcutaneous）移植時，我們可以在細胞中加入螢光素酶（luciferase）進行追蹤。你可以看到我們損失了一半的移植物。而當我們使用 GFP 報告基因來標記我們產生胰島素的細胞時，這種損失在分化狀態下甚至被放大了。所以，這方面還有很多工作要做。
另一個問題是，我們能否更好地管理同種異體排斥（allogenic rejection）？這可以透過合併療法或更好地修飾細胞來實現。那麼**自體免疫復發（recurrence of autoimmunity）**呢？有文獻指出（Pugliese et al.），如果你進行全器官移植，雖然你可以控制系統性的同種異體排斥，但自體免疫排斥會復發，並實際摧毀產生胰島素的細胞。
這只是一個簡單的點綴。我想強調的是，儘管我們正在為受影響的患者開發一種治療模式，但我們仍然不知道人類自體免疫性糖尿病是如何以及為什麼發生的！ 對我來說，你總是需要了解並理解問題，才能真正解決它。最終，我非常希望能貢獻一點力量，將第一型糖尿病（Type 1）變成「無型」（Type none）。
CD155 / TIGIT 免疫檢查點路徑
條條大路通羅馬。我們已經聽到了關於 CD45 非常精彩且充滿希望的研究。但是否還有其他路徑可以用來保護 β 細胞？我們能否在建立精確的、HLA 匹配的人類自體免疫模型時做到這一點？
我們一直專注於 CD155 和 TIGIT 檢查點抑制（checkpoint inhibition）。基本上，當 T 細胞和 NK 細胞被活化時，TIGIT 會被上調（upregulated），它們對 CD155 具有高親和力，結合後會導致抑制。然而，反過來，T 細胞上還有另一個受體 CD226，它在第一型糖尿病中有一個單核苷酸多型性（SNP），與疾病相關，它與 CD155 結合會導致 T 細胞的刺激。所以這有點像陰和陽的關係。
我們從癌症（例如黑色素瘤）中學到了很多，了解癌症如何發展出免疫檢查點調節來逃避免疫監視。最近有文獻描述了一種高親和力的 CD155 突變體 （rs1058402; G>A; Ala67Thr），這對癌症患者來說意味著預後不良。那麼，我們能否利用 CD155 來引導訊號走向 TIGIT 路徑，從而保護我們的細胞呢？
我們使用了基因體編輯技術（genome engineering）來建立三個實驗組：野生型（wild type）、CD155 對照組，以及突變體。我們使用 TALEN 介導的重組技術，將野生型或 Ala67Thr 突變型的 CD155 構築體插入 Mel1 hPSC 的 AAVS1 基因座中。當我們這樣做時，是的，我們得到了 CD155 的過度表現（overexpression）；當我們使用螢光標記的 TIGIT 時，我們可以證明，正如預期的那樣，如果我們表現野生型或突變型 CD155，它們與受體的結合會增加。結合親和力的順序為：CD155 突變體 > CD155 野生型 > Mel1。
現在我們有了經過修飾的幹細胞。我們進行了細胞生成的標準流程，使用了 GFP 報告基因，這一切都運作正常。所有細胞株都能產生大約 50% 的 sBC，這些細胞表現出我們想要的標記，它們具有功能，能對高葡萄糖產生反應，我們也能觸發放大路徑。重要的是，它們保留了 CD155 的表現。
太棒了。我們也在 sBC 的設定下測試了 TIGIT 的結合，這同樣成立。突變體具有最高的親和力，結合得非常高。當我們將其與刺激分子 CD226 進行比較時，希望你能看出曲線有一個向左的偏移，這意味著在我們的系統中，TIGIT 的親和力高於 CD226。因此，我們預期這將引導免疫反應走向抑制。
體外細胞毒性測試：T 細胞與 NK 細胞
我們如何從功能上證明這一點？我們拿這三種細胞株，它們都具有 HLA-A2 這個常見的等位基因。我們將其製成單細胞，並用干擾素-γ（interferon gamma）處理，使 HLA 第一型（HLA class I）上調，這樣 T 細胞就能識別它們。我們將它們以單細胞形式播種。當我們這樣做時，是的，三組的 HLA 都顯著上調了。重要的是，CD155 的表現並沒有改變。這是確保我們實驗模型有效運作的關鍵。
那麼 T 細胞的來源是什麼？我們現在使用的是從白血球分離術產品（leukapaks）中分離出的初始 CD8 T 細胞（naive CD8 T cells）。在這項研究中，我們進行了慢病毒轉染（lentiviral transfection），引入了一種名為 1E6 的 T 細胞受體（TCR），它會對**前胰島素原胜肽 15-24（pre-proinsulin peptide 15-24）**產生反應，這受到 HLA-A2 的限制。到目前為止，我們還有許多其他的這類「替身」（avatars），可以識別與疾病相關的其他刻板抗原，但在這裡我只展示這個。
我們將這些細胞放在一起。我忘記提到的一件重要事情是，我們用放射性同位素鉻（chromium）標記了我們的 β 細胞，進行了 51Cr 釋放細胞毒性分析（51Cr Release LEGENDplex），這樣我們稍後就可以測量鉻的釋放量。
當我們這樣做並觀察這些 T 細胞替身的活化標記時，希望你能看出它們被顯著下調了。這裡呈現雙峰分佈，我們還不明白為什麼會這樣，但它仍然具有顯著性。
跳到細胞毒性（cytotoxicity）的結果，我們發現在這個直接的自體反應分析中，隨著效應細胞與靶細胞比例（effector-target ratio）的增加，我們對細胞毒性的抑制達到了更強或更高的顯著性。這伴隨著 Fas 配體（Fas ligand）、顆粒酶 B（granzyme B）、穿孔素（perforin）以及顆粒溶素（granulysin）的減少。
太好了。這些數據表明 CD155 確實可以抑制 T 細胞的活化。但這真的是透過 TIGIT 進行的嗎？所以我們做了另一個實驗，我們使用了野生型或突變型細胞，再次製作了我們的替身細胞，但這次我們用同型對照抗體（isotype control antibody）或抗 TIGIT 抗體（anti-TIGIT）來處理它們。也就是說，我們預先處理以抑制它們的交互作用。
當我們對野生型這樣做時，因為沒有有效的交互作用，我們仍然會看到毒殺作用。當我們對突變體這樣做時，如果你抑制了 CD155 和 TIGIT 的交互作用，你會看到毒殺作用的「去抑制」（de-repression），也就是再次出現毒殺；而在同型對照組中，細胞則受到保護。這證明了這就是其作用機制。
我在一開始告訴過大家，這不僅僅發生在 T 細胞中，所以我們也開發了一種針對 NK 細胞的分析方法。這是同種異體反應（allogenic reactivity），所以我們從非 HLA-A2 的個體中提取 NK 細胞。我們首先測試細胞上的活化標記，我們看到 NK 細胞的活化顯著降低，毒殺作用也顯著減少。當我們使用抗體來證明其作用機制時，希望你能看出同型對照和突變體之間，毒殺作用被去抑制了。
因此，我希望我已經向你們展示了，野生型和突變型的 CD155 都能抑制 NK 細胞和自體反應性 T 細胞溶解 sBC 的能力。突變體的表現優於野生型，而且這非常依賴於 TIGIT 訊號傳遞。 這項研究已發表在《Science Advances》。
邁向體內模型與免疫耐受的新策略
現在，我們已經過渡到在體內（in vivo）環境中使用這些替身細胞。這一直是我們長期的目標，也可能是這個領域的迫切需求：能夠在體內進行這些測試，以更高的通量來測試我們關於如何保護這些細胞的各種不同想法。
同時，我認為我們建立了準確的體內系統來評估人類的自體反應性。這對於研究人類 β 細胞的差異性免疫原性（differential immunogenicity）至關重要。現在我表明我的立場：我認為這是一種在自體反應環境中，由 β 細胞引發的疾病。 我們需要達到一個地步，能夠操縱 β 細胞、將它們暴露於壓力下，或觀察其異質性，以了解究竟是什麼在最初驅動了這種疾病。
在最後五分鐘，我將稍微轉換一下軌道。將剛才的內容與 CD45、HLA 基因敲除（knockout）的數據，以及其他現有數據放在一起看。人們已經過度表現了在懷孕中很重要的 HLA-E 等等，現在有很多合併策略，而我們在此貢獻了 CD155 也可以列入這個清單。
但是我們能找到替代方案嗎？我一直對**調節性 T 細胞（T regs）**非常著迷，儘管我並沒有真正受過這方面的訓練。為什麼呢？因為 T regs 真的是周邊耐受（peripheral tolerance）的檢查點。這是如何促進的？是透過多種機制。我列舉了一些：它們可以釋放調節性細胞激素（如 IL-10），它們可以作為 IL-2 的「水槽」（sink，這對免疫級聯反應的傳播很重要），它們可以直接誘導自體反應細胞凋亡，並引起無能（anergy）和抑制。還有很多其他機制。
總體而言，這是一個非常有趣的細胞類型，但它很稀少。你需要以抗原特異性（antigen-specific）的方式將它送到作用部位。之前有研究在體外擴增後輸注多株（polyclonal）細胞，但效果不大。如果你以抗原特異性的方式進行，效率應該會更高。
我們從癌症研究中學到，我們現在不僅可以使用嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）來引導 T 細胞，也可以使用這種受體將調節性 T 細胞引導到我們感興趣的細胞上。
但是，我們不想使用那些已經存在且我們必須在細胞中識別的標靶，我們在想：「我們能否產生一種誘餌（bait），它只表現在我們的 β 細胞上，而不表現在其他任何地方？」理想情況下，它在生物學上是惰性的，不會干擾我們的 β 細胞，並且它應該具有中樞耐受性（central tolerance），在胸腺中表現。
CAR-Tregs 與「誘餌」系統的開發
所以我們的假設是（我可以在三分鐘內講完），我們可以對我們的 β 細胞進行基因體編輯，同時對病患的 T-reg 細胞進行基因體編輯，從而提供局部的免疫耐受，以保護 β 細胞移植物。
為了快速進行，我們使用了一對眾所周知的 CAR-誘餌組合。這是一項概念驗證研究，使用了已發表的 EGFR CAR（Cetuximab）和截短的 EGFR（EGFRt）。有一種用於癌症治療的 EGFR CAR，以及一種相關的截短 EGFR，後者缺乏細胞內訊號傳遞結構域和部分細胞外配體結合結構域，因此在生物學上是惰性的。這些序列都是公開的，我們只需訂購即可。我們就是這麼做的。
我們製造了我們的 β 細胞。我們透過 TALEN 介導的重組，將由 CAG 啟動子驅動的 EGFRt 連同螢光素酶（Luciferase）卡匣插入 Mel1 hPSC 的 AAVS1 基因座中。這樣我們就可以進行體內影像觀察。我們生成了這些細胞，完成了我們的標準流程，高水準地製造了 sBC。我們做了一些很棒的實驗，它們具有功能，而且重要的是，這些 sBC 仍然表現那種誘餌蛋白質。
接著我們使用捐贈者衍生的 T-regs。我們分離它們，使用帶有 mCherry 螢光標記的慢病毒，我們可以高度感染它們（轉導效率很高）。在這個過程中，這些 T-regs 仍然保持 T-regs 的特性（FOXP3+ HELIOS+）。雖然我沒有展示數據，但我們可以反覆刺激它們，它們依然是 T-regs。
然後我們可以使用我們修飾過的 sBC 來刺激我們的 CAR T-regs。如果 T-regs 中沒有 CAR 加上 sBC，我們不會得到活化。如果我們使用磁珠或 sBC，我們可以活化細胞。當我們將它們放在一起時，我們獲得了刺激，釋放了免疫抑制性細胞激素（如 IL-10 和 IL-13），並且我們可以在體外抑制 CD4 和 CD8 T 細胞的增殖。我們也做了一些與樹突細胞（DC cells）相關的分析，這些已經發表了，大家可以去看看。
體內驗證與未來展望
這一切在體外都很美好。如果我們進入體內（in vivo）會怎樣？我們採用了 Megan Levins 和 Francis Lynn 開發的模型。你可以使用免疫缺陷小鼠（NSG 小鼠），移植 CAR T 效應細胞（CAR-Teff），它們會尋找並歸巢到移植物（這是針對 A2 的），並摧毀 sBC 移植物。我們以此作為對照組，然後我們透過靜脈注射（IV）共同移植 Tregs（比例為 CAR-Teff : CAR-Tregs = 1:2），並使用螢光素酶來讀取發生的情況。
在這裡你可以看到，在 21 天內，只有 T 效應細胞的組別失去了所有的移植物。但在 T 效應細胞加上 Treg 的組別中，移植物得以長期存活。我們可以對此進行量化，並在事後觀察移植物。我們看到的是 CD3 的有效浸潤，誘餌蛋白質仍然存在，有大量的人類細胞。
最精彩的畫面是下一張，它說明了重點。在對照組中，我們看到大量的 CD3，幾乎沒有 FoxP3。但在治療組中，你幾乎仍然可以看到那些細胞簇，它們被調節性 T 細胞（FOXP3+）包圍著。我喜歡這麼認為：這些 Tregs 將其他 CD3 細胞阻擋在外，從而在體內長期保護我們的移植物。
因此，我們建立了一個概念驗證，證明可以利用 T-regs 的力量，為 sBC 移植物提供局部的免疫耐受機制。這項研究已發表在《Cell Reports》（Combinatorial genetic engineering strategy for immune protection of stem cell-derived beta cells by chimeric antigen receptor regulatory T cells）。
在 Breakthrough T1D 的幫助下，我們已經將這項工作推進到一個臨床相關的、與癌症無關且具有中樞耐受性的誘餌-CAR 組合，我們很興奮能推動這項工作向前發展。我們的想法是，這本身可以作為一個獨立的平台，但我認為未來的趨勢是，我們真的需要探索許多不同的模式。為了病患的利益著想，我們不應該只嘗試一種方法，而是需要團隊合作，達到一個我們能真正幫助廣大病患群體的境界。
最後，這些是我實驗室的成員，我有時還會進實驗室幫點忙，但大部分工作都是他們做的。這些是來自各個機構和組織支援的大學生。感謝我的合作者 Todd Brusko、Leo Ferreira 和 Maki Nakayama，以及捐贈者和他們的家屬。感謝 ADA、Breakthrough T1D 和 NIH 的資金支持。如果你覺得這很具啟發性，並且想參與更多這類研究，你的名字可以出現在這裡。只要發封電子郵件給我即可。非常感謝大家。
Q&A
主持人： 我們有任何問題嗎？我認為這是一場非常精彩的演講。這涉及了解所有的免疫學、自體免疫、同種異體排斥，並開發標靶療法。所以，也許我來問一個問題：我們是否已經具備了所有的試劑和非臨床藥理學基礎，可以來測試……考慮到小鼠模型的限制，你打算如何在體外測試將這些模型人類化？
Holger Russ： 是的，所以……你知道，我們以及癌症領域，我認為我們很擅長在實驗性臨床前設定中分析同種異體（allo）和某些方面的異種反應性（xeno reactivity），但我們在**自體反應性（autoreactivity）**方面做得並不好。而且當你說：「好吧，我使用第一型糖尿病患者的 PBMC（周邊血單核細胞）」時，如果你使用一百萬個細胞，裡面大概只有三個自體反應性 T 細胞。
所以，我對推進這些模型的前景非常著迷。我們有論文實際使用了人類化 HLA 的 NOD 小鼠，以促進細胞遷移、外滲（extravasation）等等。這是一個相當長的回答，但簡而言之，我認為我們需要一種組合策略，沒有一種方法可以一體適用。這取決於我們要解決的問題。我們需要微生理系統（micro-physiological systems）、生物工程師；我們需要體外研究，因為我們可以進行還原論（reductionary）的分析；我們也需要臨床前研究。然後我們需要有人真正接手這些成果，並將其應用於首批病患身上，因為這是推動該領域發展的終極測試。這幾種方式真的需要齊頭並進，希望到我退休的時候，我們可以回顧這些成功，而病患們也能睡得更安穩。