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Immune Repertoire Profiling for Accurate Classification of Latent Autoimmune Diabetes in Adults
ADA2026

Immune Repertoire Profiling for Accurate Classification of Latent Autoimmune Diabetes in Adults

2026-06-05

Immune Repertoire Profiling for Accurate Classification of Latent Autoimmune Diabetes in Adults（LADA）

報告者：Xiaorui Lyu，Shanghai Sixth People’s Hospital
主題：利用 T cell receptor（TCR）免疫受器庫 profiling，更深入理解 Latent Autoimmune Diabetes in Adults（LADA） 的免疫特徵，並改善其與第 1 型、第 2 型糖尿病之分類。

LADA 的矛盾表型：像 T1D 的免疫、像 T2D 的臨床

LADA 是一種高度異質性的糖尿病。從免疫學角度來看，LADA 與第 1 型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）共享重要特徵：其直接病理基礎涉及 autoreactive T cell 與 B cell responses，臨床診斷也依賴 islet autoantibodies（胰島自體抗體） 的存在。換言之，LADA 的核心仍帶有自體免疫性質。

但從臨床表現來看，LADA 又很像第 2 型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）：患者通常是成人發病，可呈現不同程度的 insulin resistance，而且在疾病早期通常不需要立即接受 insulin treatment。因此，LADA 同時具有 T1D-like immune phenotype 與 T2D-like clinical symptoms，造成診斷與分類上的挑戰。

背景資料指出，約有 8.9% 一開始被診斷為 T2D 的患者，最終會被辨識為 LADA；此數據來自 Diabetes Metabolism Research and Reviews 2016 的相關報告。這使得一個關鍵問題浮現：是否能找到更深層的免疫特徵，用來區分 LADA、T1D 與 T2D？

過去研究已指出，LADA 的胰島環境中可見 Th1 cells 與 CD8+ T cells 增加。這些細胞能分泌發炎性 cytokines，進而誘發 β-cell death。另一方面，regulatory T cells（Treg） 可能透過 IL-10、TGF-β 等 cytokines 參與 immune tolerance 的維持。也就是說，LADA 不是單純的免疫活化狀態，而可能同時包含免疫攻擊與免疫調節。

病理機制圖中進一步整合了多種免疫細胞：pDC、cDC、M1 macrophage、M2 macrophage、B cell、NK/NKT cells、Th1、CD8+ T cells 與 Treg。CD8+ T cells 可透過 granzyme/perforin 促進 β-cell apoptosis；Th1 與其他發炎細胞可產生 IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-12 等發炎訊號；B cells 與 autoantibodies 參與自體免疫反應；Treg 與 M2 macrophage 則與 IL-10、TGF-β 等免疫抑制或耐受機制相關。

然而，既有研究多集中在 cell proportions 或 cytokine profiles，只能提供相對片段的免疫圖像。若要更精準理解 LADA 的免疫特徵，就需要能夠直接反映抗原辨識與克隆擴張狀態的免疫指標。

TCR repertoire：用抗原辨識分子描繪免疫特徵

T cell receptor（TCR）是 T cell 進行 antigen recognition 的核心分子。結構上，TCR 主要由 α chain 與 β chain 組成，每條鏈都包含與抗原辨識相關的區域。TCR 的高度多樣性，使 T cells 能辨識非常廣泛的抗原，包括 viral antigens、tumor antigens 與 autoimmune antigens。

TCR 結構可分為 variable、constant、transmembrane 與 cytoplasmic regions；其中 TCRα 通常涉及 V-J recombination，TCRβ 則涉及 V-D-J recombination。CDR1、CDR2、CDR3 是與抗原辨識密切相關的 complementarity-determining regions，其中 CDR3 尤其常被視為抗原特異性與克隆差異的重要來源。人體 TCR repertoire 理論多樣性可達 10^13–10^14。

TCR sequencing 提供一種 high-throughput 方法，可用來量化 immune repertoire features。本研究聚焦幾個關鍵指標：

  • Shannon index：反映 TCR repertoire diversity。
  • Clone number / clonotype number：反映不同 TCR clones 的數量與豐富度。
  • Gini index：反映 clone distribution 的不均衡程度。
  • DE50：反映 clone distribution，亦可用於判斷 repertoire 是否被少數大型克隆主導。

Shannon index 與 clone number 可協助評估 TCR diversity；Gini index 與 DE50 則較能描述 clonal distribution，即克隆是否集中、是否有 dominant clones、或是否呈現較平均分布。

TCR sequencing 的技術面可依 template 分為 genomic DNA（較穩定）與 RNA（較反映即時表現），依方法分為 bulk sequencing（高通量）與 single-cell RNA sequencing（可取得較特異的細胞層級資訊），讀長也可分 short-reading 與 long-reading。分析上除 Shannon、Gini、DE50 外，也可使用 Simpson index、clonality index、Jaccard index、Morisita-Horn similarity 等指標。TCR-seq 已廣泛用於 antigen discovery、adoptive cell transfer、antigen specificity prediction、immunotherapy biomarkers，以及跨時間或跨組織的 clonal tracking。

在腫瘤、感染、過敏免疫與多種免疫疾病中，TCR sequencing 已被廣泛應用。但在 metabolic diseases 中，目前多數研究仍集中在 classic T1D，而 LADA 的 TCR repertoire 仍相對缺乏研究。

既有 T1D 研究已顯示，classic T1D 可能呈現特定 TCR repertoire 改變，例如 repertoire similarity、diversity 或特定克隆的變化；血液中也曾發現特殊的 TCR/BCR double-positive cells，可辨識與糖尿病相關的 HLA-DQ8 分子或相關抗原結構。此外，TCR number 與診斷年齡之間可能呈負相關。

相關 T1D 研究方向包括 insulin peptide presentation by HLA-DQ8、Ins-B9-23 peptide、mimotope、insulin-specific TCR/BCR cells，以及利用 scRNA-seq 或 immune repertoire 分析辨識 diabetogenic T cells。這些背景凸顯：若 TCR repertoire 能揭示 classic T1D 的抗原驅動免疫特徵，也可能有助於解析 LADA 的獨特免疫狀態。

因此，本研究的核心問題是：LADA 的 TCR repertoire characteristics 與 clonal distribution 是什麼？它是否能幫助 LADA 與其他糖尿病類型分類？

研究設計：四組受試者、PBMC TCR sequencing 與年齡校正

為回答上述問題，研究收集四組受試者：

  • Healthy donors（HD）
  • LADA
  • T1D
  • T2D

研究從 PBMCs 中萃取材料並進行 TCR sequencing，再進行 repertoire 指標與統計分析。由於年齡會影響 immune repertoire，後續 association analysis 皆進行 age adjustment，以降低年齡造成的潛在 confounding。

研究流程包含 sample collection、TCR sequencing 與 data analysis；樣本數為 HD 20 例、LADA 20 例、T1D 20 例、T2D 15 例。分析重點包括 clonality、diversity 與 classification model。

基線資料顯示，各組年齡分布不同：HD 約 50.7 歲、LADA 約 46.3 歲、T1D 約 34.0 歲、T2D 約 58.6 歲；LADA 的診斷年齡約 37.7 歲，T1D 約 22.1 歲，T2D 約 51.1 歲。BMI 中位數大致為 HD 24.6、LADA 23.0、T1D 22.1、T2D 25.5 kg/m²。糖化指標方面，LADA、T1D、T2D 的 HbA1c 約落在 7.1–7.8% 範圍，HD 約 5.75%。

胰島自體抗體方面，LADA 組抗體陽性比例較高，表格中可見 GADA、IA-2A、ICA、IAA、ZnT8A 等抗體項目；其中 LADA 組 GADA 陽性約 50%，整體抗體陽性約 55%。值得注意的是，HD/control 組中有 1 位 ZnT8A antibody positive 個體，後續討論時主席特別建議此類個體不宜保留在健康對照組中。

LADA 的 TCR repertoire：多樣性增加、但不是大型克隆主導

首先，在 TCRα chain 與 TCRβ chain 中，LADA 都呈現最明顯的 repertoire 改變：clone number、Shannon index 與 DE50 最高，而 Gini index 最低。這代表 LADA 的 TCR diversity 增加，而且其 repertoire 並非由少數高度擴張克隆完全主導。

從 clonal distribution 進一步分析，LADA 的特徵不是 large clones 或 hyper-expanded clones 增加，而是 medium-frequency clones 增加。這一點很重要，因為若是急性、強烈、單一抗原驅動的免疫反應，常可能看到大型或超大型 clones 的擴張；但 LADA 中增加的是中等頻率 clones，較符合一種 慢性、較溫和但持續存在的 autoimmune process。

DE50 與 clone-size 分層可將 clones 分為 rare、small、medium、large、hyper 等類別。本研究結論特別強調 LADA patients 的 medium clones 增加，而非主要由 large/hyper clones 擴張所造成。

這種模式符合 LADA 的臨床特性：不像 classic T1D 常呈現較快速 β-cell destruction，LADA 通常進展較慢，早期不需立即 insulin。其 TCR repertoire 中 medium clones 的擴張，可能正反映了較長期、較慢速、較分散的自體免疫壓力。

V-J / V(D)J recombination bias：LADA 的多樣性不是隨機增加

接著分析 V-J recombination pattern。無論 TCRα chain 或 TCRβ chain，LADA 相較於 HD、T1D、T2D 都呈現 biased V-J recombination pattern。這表示 LADA 中觀察到的 TCR diversity 增加並不是完全隨機，而可能由特定 V/J gene combinations 的偏好使用所驅動。

換言之，LADA 的 TCR repertoire 並非只是「更多樣」，而是「有方向性地更多樣」：某些 V-J pairing 或 V(D)J usage 在 LADA 中更常被使用，暗示背後可能存在共同抗原刺激、共同免疫路徑，或與 LADA 特異病程相關的免疫選擇壓力。

V-J heatmap 顯示 LADA 在 TCRα 與 TCRβ 兩個層面皆與其他組別不同；雖然 TCRβ 的生物學重組包含 V-D-J，但圖像分析以 V-J pairing / VJ usage pattern 呈現偏倚，支持「increased TCR diversity is driven by biased V-J recombination」的判讀。

LADA 患者之間的 TCR repertoire 更相似：共享且相對穩定的免疫圖像

在 repertoire similarity 分析中，LADA patients 之間呈現更高的 TCR repertoire similarity。Heatmap 與 similarity index 均指出，LADA 相較其他糖尿病亞型具有更一致的 repertoire pattern。

這項結果與前述 V-J bias 互相呼應：如果 LADA 的 TCR diversity 增加只是隨機現象，不一定會看到患者之間更高的相似性；但本研究觀察到 LADA 患者間 TCR repertoire 更相似，暗示其免疫反應可能具有相對共享、穩定的特徵。

similarity analysis 使用 Morisita similarity / Morisita-Horn similarity 來評估不同個體 repertoire 的重疊與相似程度；LADA 顯示較高相似性，支持其可能存在 shared immune-repertoire pattern，而非單純個體差異。

Cytokine profile：LADA 同時具有免疫活化與免疫抑制訊號

研究進一步檢視 cytokine profiles。LADA 顯示與 Th1 與 CD8+ T cell activation 相關的 cytokines 增加，符合自體免疫攻擊與 β-cell injury 的概念。Th1 / CD8+ T cell-associated cytokines 上升，代表 LADA 仍具有明顯 inflammatory immune activation。

同時，研究也觀察到 IL-10 增加與 IL-6 降低。IL-10 與 Treg function、免疫調節及免疫耐受有關；IL-6 則常與發炎反應、Th17 differentiation 等免疫活化路徑相關。這種組合使 LADA 呈現一種雙重特徵：一方面有 autoimmune activation，另一方面也有 immune suppression 或 regulatory compensation。

cytokine panel 包含 IL-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等 Th1 / CD8+ T cell-associated inflammatory cytokines；圖中顯示 LADA 相關比較達統計顯著，例如 IL-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 分別呈現顯著差異訊號。調節性 cytokine 部分包含 IL-10、IL-6 與 IL-4，其中 IL-10 升高、IL-6 降低，支持 immune activation and suppression 並存的結論。

這也解釋了為何只用單一 cytokine 或單一免疫細胞比例，可能不足以描述 LADA。LADA 的免疫狀態不是單純「發炎」或「耐受」，而是兩者交織：慢性自體免疫攻擊持續存在，同時身體可能啟動免疫調節機制試圖限制損傷。

TCR 指標與 autoantibodies、cytokines 相關：連結 repertoire 與 LADA 自體免疫活性

接著分析 TCR repertoire 與 autoantibodies、cytokines 之間的關係。即使在校正年齡後，TCR 指標仍與胰島自體抗體及 cytokine profiles 相關。這項結果是關鍵，因為它證明 TCR repertoire 不只是單獨的 sequencing 指標，而是與 LADA 的自體免疫反應和 cytokine-mediated immune activity 具有實際連結。

換句話說，TCR diversity、clonal distribution、specific clone-size categories 等變化，並非與臨床免疫現象無關的背景雜訊，而可能反映了 LADA 中抗原驅動的自體免疫狀態。

age-adjusted heatmap 納入 TRA 與 TRB 多種變項，包括 normalized clonotypes、normalized Shannon、DE50、Gini、hyper clones、large clones、medium clones、small clones 與 rare clones，並分別與 islet autoantibodies 及 cytokines 進行相關性分析。結果顯示多個 TRA/TRB repertoire features 在校正年齡後仍與免疫表型相關。

此結果也為後續分類模型提供合理基礎：如果 TCR repertoire 真能捕捉 LADA 的免疫本質，那麼將其納入 classification model，理應可改善 LADA 與其他糖尿病類型之間的區分。

Random forest classification：TCR 可改善 LADA 與 T1D 的分類

最後，研究探討 TCR repertoire 是否能協助辨識 LADA，尤其是將 LADA 與 T1D 區分開來。這是一個臨床上重要的問題，因為 LADA 與 T1D 都常依賴 islet autoantibodies 進行診斷，兩者在免疫表型上有重疊；但臨床進展、發病年齡、insulin requirement 與 β-cell decline speed 又不完全相同。

研究建立 random forest model，並使用另一個 cohort 進行驗證。首先評估 conventional markers：僅使用 autoantibodies 時，模型達到中等程度表現；加入 clinical indicators 後，表現略有改善，但整體 discriminative power 仍有限。這代表傳統 clinical markers 與 antibody markers 雖有資訊量，但不足以精準區分 LADA 與 T1D。

當 TCR indices 被納入 random forest model 後，分類表現明顯提升。因此，TCR repertoire 可能作為 LADA classification 的潛在工具。

machine learning workflow 包含 repertoire variables 的篩選與建模：univariable differential analysis、univariable logistic regression、與 phenotype 的 correlation analysis、classification model、mediation analysis；資料採 7:3 train-test split，並進行 5-fold cross-validation。外部驗證 cohort 包含 LADA 15 例與 T1D 15 例。流程圖中列出 all TCR and BCR variables，但本次報告主軸集中在 TCR。

在 LADA vs T1D 的 random forest classification 中，autoimmune antibodies-only model 的 train AUC 約 0.770、train accuracy 約 0.750；test AUC 約 0.667、test accuracy 約 0.583。clinical indicators model 的 train AUC 約 0.826、train accuracy 約 0.786；test AUC 約 0.680、test accuracy 約 0.750。這些數據支持傳統指標有一定辨識能力，但仍存在限制；加入 TCR repertoire 後可進一步改善分類。

結論：LADA 具有特殊 TCR repertoire，可支援 precision immunophenotyping

本研究顯示，LADA 具有特殊 TCR repertoire characteristics，核心特徵包括：

  • TCR diversity 增加。
  • clone number、Shannon index、DE50 上升。
  • Gini index 降低，表示 repertoire 較不被少數大型 clones 主導。
  • clonal distribution 以 medium clone expansion 為主要特徵，而非 large/hyper clone expansion。
  • V-J / V(D)J usage 呈現 biased recombination pattern。
  • LADA 患者間 TCR repertoire similarity 較高，暗示 shared and relatively stable immune-repertoire pattern。
  • TCR features 與 autoantibodies、cytokines 在 age-adjusted analysis 後仍相關。
  • 納入 TCR indices 可改善 LADA classification，特別是與 T1D 的鑑別。

研究總結圖將流程概括為：PBMCs → target RNA extraction → TCR immunosequencing → diversity increase 與 medium clones increase。其總結重點為：LADA exhibits a special TCR repertoire characterized by increased diversity and medium clonal expansion；diabetes subtypes across TCR repertoires 的差異可作為 precision immunophenotyping 的基礎。

會後討論：研究設計與解讀上的技術提醒

主席提出兩點評論與一個技術問題。

第一，健康對照組中有一位 ZnT8A antibody positive individual。主席認為，若 control group 中出現胰島自體抗體陽性個體，建議應將該個體排除，避免影響 healthy control 的定義與比較結果。

第二，研究呈現了很漂亮的 VDJ usage data，但尚未深入分析 CDR3 regions。主席指出，CDR3 length variation 可能是 TCR repertoire 研究中非常重要的組成，未來值得納入分析。這點與 TCR biology 相符，因為 CDR3 通常最直接參與 antigen specificity 的形成。

第三，主席詢問 sequencing depth 與 undersampling 問題。由於人體 TCR repertoire 極其龐大，任何 TCR-seq 研究都可能面臨 undersampling：也就是實際抽樣到的 TCR sequences 只佔全身 repertoire 的極小部分。因此，他詢問每位受試者實際能取得多少 TCR sequences。現場回答未能明確給出每位個體實際 reads 或 clonotypes 數量，討論轉為會後進一步確認。這也提醒後續研究在報告 TCR repertoire 時，應清楚呈現 sequencing depth、unique clonotypes、reads per sample 與 normalization 方法。

另一位提問者指出，在 VDJ heatmap 中，T1D group 看起來比 LADA 更接近 T2D；但一般臨床概念常將 LADA 視為 adult-onset、slowly progressive 的 T1D-like subgroup。為何本研究中 T1D 反而與 T2D 更相似，而 LADA 更不同？

回答認為，這可能與 diabetes duration 與 age 相關。本研究中的 T1D 受試者並非新發病族群，年齡與病程可能影響 immune repertoire；隨著病程進展，某些 autoantibodies 也可能轉陰，進而影響觀察到的 TCR pattern。因此，T1D 與 LADA 在 heatmap 上的差異，可能部分反映研究 cohort 的年齡、病程與免疫狀態，而不僅是疾病分類本身。

Take-home Summary

  • LADA 是免疫上像 T1D、臨床上像 T2D 的異質性糖尿病，傳統 clinical markers 與 autoantibodies 仍不足以完全精準分類。
  • TCR repertoire 可直接反映 T cell antigen recognition 與 clonal expansion，因此是理解 LADA 自體免疫特徵的重要工具。
  • 本研究發現 LADA 的 TCR diversity 增加，並以 medium-frequency clonal expansion 為主要特色，符合慢性、較溫和但持續的 autoimmune process。
  • LADA 的 V-J / V(D)J recombination pattern 具偏倚，且患者之間 TCR repertoire similarity 較高，暗示共享且相對穩定的免疫受器庫特徵。
  • LADA 同時呈現 Th1/CD8+ T cell-related immune activation 與 IL-10-associated regulatory / suppressive signals，顯示免疫活化與免疫調節並存。
  • TCR indices 與 autoantibodies、cytokines 在校正年齡後仍相關，支持其作為 LADA immune phenotype marker 的合理性。
  • 將 TCR repertoire 納入 random forest classification，可提升 LADA 與 T1D 的鑑別能力，為 precision immunophenotyping 與更精準的糖尿病分類提供基礎。