Modeling In-Utero Glucose Exposure Using Indigenous American iPSC-Derived Pancreatic Islets

講者：Anup K. Nair（NIDDK/NIH）
隸屬：Phoenix Epidemiology and Clinical Research Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases（NIDDK/NIH）。本報告屬於 Human Islet Cell Identity and Organization 相關口頭報告場次，題目為「Modeling in-utero glucose exposure using Indigenous American iPSC-derived pancreatic islets」。

研究揭露與倫理脈絡：以 Indigenous American iPSC 作為模型

本研究沒有利益衝突揭露。研究使用來自 Indigenous Americans（美洲原住民族） 的樣本，在此案例中主要是 iPSC（induced pluripotent stem cells），因此研究設計與執行特別依循與原住民族合作研究相關的倫理規範。

研究是在 CONSIDER statement 的原則下進行，也取得相關部落審查委員會核准。具體而言，研究資料／樣本來自 Indigenous Americans，並依據「CONSIDER statement for research in partnership with Indigenous people」執行；核准單位包括 Tribal Research and Review Committee 以及 Health and Social Standing Committee。

這個開場不只是行政揭露，也設定了整個研究的核心脈絡：這不是一般細胞模型研究，而是試圖在尊重族群研究倫理的前提下，理解一個在 Indigenous American 群體中尤其重要的糖尿病風險來源——母體妊娠期間糖尿病所造成的子代代謝風險。

背景：母體妊娠期間糖尿病是子代第 2 型糖尿病的重要風險因子

NIDDK Phoenix branch 過去的流行病學研究，是最早顯示 maternal diabetes during pregnancy（母體妊娠期間糖尿病） 會對子代未來第 2 型糖尿病風險產生不良影響的研究之一。這項風險在 Indigenous Americans 中尤其重要。

以子代不同年齡層的第 2 型糖尿病盛行率來看，如果母親在懷孕前已經罹患第 2 型糖尿病，則子代在各年齡層都呈現非常高的第 2 型糖尿病盛行率；相比之下，如果母親是在該次懷孕之後才發展出第 2 型糖尿病，子代風險明顯較低。這種比較提供了強烈線索：單純的遺傳或家庭環境不能完全解釋風險差異，子宮內暴露於糖尿病／高血糖環境本身，可能在子代早期發育中留下持久影響。

背景資料中比較了三類母體糖尿病狀態：母親在懷孕前後皆未罹患第 2 型糖尿病、母親在該次懷孕後才發展第 2 型糖尿病、以及母親在懷孕前已罹患第 2 型糖尿病。子代年齡分層包括 5–9、10–14、15–19、20–24、25–29 歲；母親懷孕前已罹病者，其子代第 2 型糖尿病盛行率在各年齡層均最高。

這些觀察與 Phoenix branch 先前幾篇經典研究相互呼應。相關文獻包括 David J. Pettitt、Kirk A. Aleck、H. Robert Baird、Michael J. Carraher、Peter H. Bennett、William C. Knowler 等人的「Congenital Susceptibility to NIDDM: Role of Intrauterine Environment」；Dana Dabelea、Robert L. Hanson、Robert S. Lindsay、David J. Pettitt、Giuseppina Imperatore、Momin M. Gabir、Janine Roumain、Peter H. Bennett、William C. Knowler 等人的「Intrauterine Exposure to Diabetes Conveys Risks for Type 2 Diabetes and Obesity: A Study of Discordant Sibships」；以及 Jean-Francois Gautier、Charlton Wilson、Christian Weyer、Dave Mott、William C. Knowler、Melissa Cavaghan、Kenneth S. Polonsky、Clifton Bogardus、Richard E. Pratley 等人的「Low Acute Insulin Secretory Responses in Adult Offspring of People With Early Onset Type 2 Diabetes」。

另一個關鍵觀察是：那些母親在懷孕前就罹患第 2 型糖尿病的子代，在自己尚未發展出第 2 型糖尿病之前，就已經可見 acute insulin secretory response（急性胰島素分泌反應）較低。這表示母體糖尿病所造成的子宮內環境，可能不只是增加肥胖或胰島素阻抗風險，也可能直接影響 β-cell development（β 細胞發育），使子代在生命早期就帶有較低的胰島素分泌能力或分泌動態缺陷。

因此，本研究的核心問題是：如果母體糖尿病造成胎兒發育期間的高葡萄糖暴露，那麼在胰島／β 細胞發育過程中，葡萄糖暴露究竟會造成什麼樣的細胞組成、功能、轉錄體與表觀遺傳變化？這些變化是否能在移除高糖刺激後仍持續存在？

模型系統：以 iPSC 衍生胰島模擬胰島發育與成熟

為了研究「推定的子宮內葡萄糖暴露」如何影響發育中的胰島，本研究使用一個可由 iPSC 產生成熟胰島的模型系統。實驗室已建立一套分化流程，盡量模擬人類胚胎胰島發育過程。

流程起點是 iPSC。經過約 10 天分化後，可產生 multipotent pancreatic progenitor cells（多潛能胰臟前驅細胞，pancreatic progenitors, PPs）。這些前驅細胞再經過 endocrine progenitor stage（內分泌前驅階段），可形成 immature SC-islets（未成熟 stem-cell-derived islets）。這些未成熟胰島在 transcriptomic profile 上類似胎兒胰島。之後，未成熟胰島可進一步成熟，到了 day 34 取得 GSIS（glucose-stimulated insulin secretion，葡萄糖刺激胰島素分泌） 能力，轉錄體特徵也更接近成人胰島。

流程可概念化為：iPSCs 經 adherent culture 形成 pancreatic progenitors，接著進入 endocrine progenitor 階段，再於 3D culture 中形成 immature SC-islets，最後成熟為 mature SC-islets。時間軸上，iPSCs 至 PPs 約 10 天；PPs 至 day 20 immature SC-islets 約再 10 天；day 20 至 day 34 mature SC-islets 約 14 天。模型中也可將成熟胰島維持至 day 41、day 58、day 70，用於長期培養與慢性葡萄糖暴露研究。

這個模型的功能成熟度可由 perifusion GSIS 來驗證。未成熟胰島尚未具有明顯葡萄糖反應；在 20 mM glucose 刺激下，胰島素分泌沒有顯著上升。相對地，成熟的 stem-cell-derived islets 對葡萄糖有清楚反應：在 20 mM glucose 刺激下，可見明顯的急性第一相胰島素分泌，以及持續的第二相分泌。

此外，這些細胞維持在培養中的時間越長，通常胰島素分泌能力越好。也就是說，成熟過程不只是時間點上的分類，而是伴隨功能逐步增強。

實驗室所產生的成熟胰島中，約有 35–55% 為功能性 β 細胞。這裡的功能性 β 細胞定義為同時表現 insulin（INS） 與 β 細胞轉錄因子 NKX6.1 的細胞。

模型驗證中包含以 2G、20G、KCl 與 diazoxide 等條件觀察胰島素分泌反應；成熟 SC-islets 自 day 34 起取得 GSIS，並可在 day 41、day 58、day 70 持續觀察刺激指數與分泌能力。細胞組成則以 INS 與 NKX6-1 雙陽性作為功能性 β 細胞 readout。

實驗設計：分開檢驗「發育期高糖」與「成熟期高糖」的影響

研究者從 Indigenous American 受試者取得 iPSC，並將 iPSC 分化為 pancreatic progenitors。這個階段的 pancreatic progenitors 尚不表現 insulin，而 β 細胞命運承諾是在此之後才發生。因此，這個時間點非常適合用來模擬胎兒早期胰島發育期間的葡萄糖暴露。

研究設計的第一步，是將 pancreatic progenitors 暴露於兩種葡萄糖條件：

5.5 mM glucose：低／較生理性葡萄糖條件
25 mM glucose：高葡萄糖條件，用來模擬高糖暴露

這些 pancreatic progenitors 接著分化為 day 20 immature SC-islets。對這些 day 20 未成熟胰島，研究者進行 multi-omics 分析，以檢視早期葡萄糖暴露對轉錄體與表觀遺傳的影響。

day 20 immature SC-islets 的分析包含 epigenetics 與 transcriptomics：ATAC-seq、RRBS、RNA-seq、real-time PCR；並搭配功能面分析，如 insulin secretion、hormone content、islet composition、stress effect、apoptosis，以及後續訊號追蹤。相關 day 20 multi-omic 分析另以 poster 2669-P 呈現，時間為 Monday 12:30–1:30。

第二步，是將這些在不同發育期葡萄糖條件下形成的 immature islets，再分別暴露於 5.5 mM 或 25 mM glucose 進行成熟。因此整個實驗形成四種組合，用以區分高糖暴露發生在「發育期」或「成熟期」的不同效應：

條件	發育期 glucose	成熟期 glucose	解讀
A1	5.5 mM	5.5 mM	參考組；全程未高糖暴露
A3	5.5 mM	25 mM	僅成熟期高糖暴露
C1	25 mM	5.5 mM	僅發育期高糖暴露
C3	25 mM	25 mM	發育期與成熟期皆高糖暴露

這個設計的強項在於它能拆解兩個問題：

高糖若發生在 β 細胞命運承諾與胰島形成之前，是否會改變後續胰島組成與功能？
高糖若發生在胰島已形成、進入成熟階段後，其效果是否不同？
發育期造成的變化，在移除高糖後是否仍然保留？

胰島組成：高糖暴露對 β 細胞比例的影響很小，功能差異不能單純歸因於細胞數

研究首先檢視四種條件下形成的胰島組成，特別是功能性 β 細胞比例。分析使用 flow cytometry，樣本來自四條不同 iPSC lines 分化出的胰島。功能性 β 細胞仍定義為 INS 與 NKX6.1 雙陽性。

整體而言，四種條件都能產生相當數量的功能性 β 細胞，表示高糖處理並沒有造成明顯失敗的胰島分化。不過仍可見一些細微差異：以字母 C 代表的條件，也就是發育期暴露於高糖的胰島，功能性 β 細胞比例略高；相對地，成熟期高糖暴露，也就是編號上的差異，對 β 細胞數量沒有明顯影響。

但這些差異非常小，β 細胞比例差距不到 5%。因此後續觀察到的胰島素分泌差異，不能簡單解釋為某一組產生了更多或更少 β 細胞。

在 day 34 SC-islets 中，A1 vs C1 的功能性 β 細胞比例差異約為 4.8% ± 1.8%；A3 vs C3 約為 4.8% ± 2.1%。這些差異雖可偵測到，但幅度小，且不足以單獨解釋後續 GSIS 的相位性分泌缺陷。

接著研究者檢測 hormone content，尤其是 total insulin content 與 proinsulin/insulin ratio。四種條件間 total insulin content 沒有顯著差異；proinsulin/insulin ratio 也沒有顯著差異。所有胰島中的 proinsulin/insulin ratio 都低於 0.1，表示大部分 proinsulin 都能有效轉換為 insulin，胰島素加工成熟本身沒有明顯缺陷。

day 34 SC-islets 的 hormone content 分析包含 insulin content（以 uU/μg DNA 表示）與 proinsulin/insulin ratio。四組 A1、A3、C1、C3 的 insulin content 與 proinsulin/insulin ratio 皆未呈現明顯組間差異；proinsulin/insulin ratio 約落在 0.1 以下。

這一段結果非常重要：它排除了幾個簡單解釋。若後續看到 insulin secretion 降低，並不是因為：

β 細胞大量減少；
total insulin content 不足；
proinsulin processing 大幅異常。

因此功能差異更可能來自 β 細胞的 glucose sensing、membrane excitability、secretory coupling、或相關 transcriptional/epigenetic programming 改變。

GSIS 功能分析：成熟期高糖影響第一相，發育期高糖影響第二相

接著研究者檢驗 glucose-stimulated insulin secretion（GSIS）。方法是 perifusion GSIS，使胰島依序暴露於不同葡萄糖濃度，並連續測量 insulin secretion。

典型流程如下：胰島先在 2 mM glucose 下灌流作為低糖基線；接著切換至 11 mM glucose，此時可觀察到急性第一相胰島素分泌，以及持續第二相分泌；之後再回到 2 mM glucose，分泌下降回基線；接著以 20 mM glucose 進行最大刺激，再次觀察第一相與第二相分泌；最後再回到 2 mM glucose。

在這個 perifusion 圖形中，四種葡萄糖暴露條件明顯影響胰島素分泌型態。尤其是 A3，也就是發育期未高糖、成熟期高糖的胰島，在回到 2 mM glucose 時，胰島素分泌回到基線的反應比較慢，顯示成熟期高糖可能造成葡萄糖刺激後關閉分泌反應的動態延遲。

GSIS 圖中使用 day 34 SC-islets，胰島素分泌以 % total insulin/min 表示；流程包含 2G → 11G → 2G → 20G → 2G，並展示來自不同 iPSC-derived islets 的代表性 perifusion 曲線。

為了量化這些差異，研究者將 perifusion insulin secretion 以 area under the curve（AUC） 分析，分別比較 11 mM 與 20 mM glucose 下的第一相與第二相。

AUC 分析來自 9 次 independent differentiations、4 條不同 iPSC lines；統計比較使用 ANOVA，顯著性標示為 * adjusted P < 0.05、 adjusted P < 0.01。

第一相胰島素分泌：成熟期高糖暴露造成下降

在 submaximal glucose（11 mM）與 maximal glucose（20 mM）刺激下，第一相胰島素分泌呈現清楚模式：相較於參考組 A1，在成熟期暴露於高糖的胰島，也就是 A3 與 C3，第一相分泌 AUC 顯著降低。

這代表成熟期高糖暴露主要傷害的是急性 insulin secretory response。第一相分泌通常反映 readily releasable pool、glucose sensing 後快速觸發的 exocytosis，以及 β 細胞對葡萄糖上升的即時反應能力。此結果與流行病學研究中子代較低 acute insulin secretory response 的觀察有機制上的呼應。

第二相胰島素分泌：發育期高糖暴露造成下降

第二相胰島素分泌則呈現不同模式。顯著降低的是發育期暴露於高糖的胰島，也就是 C1 與 C3。不論在 11 mM 或 20 mM glucose 下，C1 與 C3 的第二相 insulin secretion AUC 都較低。

這表示高糖若發生在 pancreatic progenitor 到 immature islet 的發育階段，即使後續成熟期回到 5.5 mM glucose，仍會留下影響第二相分泌的功能缺陷。

四組 GSIS 結論

相較於全程低糖參考組 A1：

A3（成熟期高糖）：第一相 insulin secretion 降低，且對回到 2 mM glucose 的反應較慢。
C1（發育期高糖）：第二相 insulin secretion 降低。
C3（發育期與成熟期皆高糖）：同時出現第一相與第二相 insulin secretion 降低。

day 34 mature SC-islet GSIS 摘要可整理為：A1 為 reference；A3 主要呈現 1st phase 下降與對 2G response 較慢；C1 主要呈現 2nd phase 下降；C3 同時呈現 1st phase 與 2nd phase 下降。

這裡的重點是，高糖暴露的時間窗決定了功能缺陷的型態。成熟期高糖比較像急性／較後期代謝壓力，影響快速分泌反應；發育期高糖則可能重塑 β 細胞的發育程式，造成較持久的第二相分泌缺陷。

RNA-seq 轉錄體分析：成熟期高糖與發育期高糖誘發不同基因程式

為了理解 GSIS 差異背後的分子基礎，研究者進行 RNA-seq 分析。結果顯示，葡萄糖暴露的時間點對轉錄體影響有明顯差異，可大致分成兩組基因模式。

成熟期高糖暴露：誘發急性葡萄糖反應基因，並對第一相分泌相關基因產生影響

在成熟期暴露於高糖的胰島中，許多差異表現基因是已知會急性回應葡萄糖的基因，例如：

TXNIP
RGS16
RBPMS2

這些基因的 promoter 中具有 glucose-responsive elements，因此它們的變化符合成熟 β 細胞對高糖刺激的急性轉錄反應。

同時，也看到一些過去未被明確歸類為急性葡萄糖反應基因的新候選基因，例如：

DMBT1
NOTUM
ATOH8

這些基因已知可直接影響第一相胰島素分泌，因此與 A3、C3 中第一相分泌下降的功能結果相一致。

成熟期高糖暴露相關 volcano plot 中，除 TXNIP、RGS16、RBPMS2 外，還標示 ALDH5A1、HACD1、SCD5、G0S2、DMBT1、ELFN1、NOTUM、SMOC2、G6PC2、SLC26A4 等基因，顯示成熟期高糖主要誘發一組偏向急性葡萄糖反應與分泌調控的轉錄程式。

發育期高糖暴露：影響通道蛋白與 β 細胞去極化相關基因

相較之下，發育期暴露於高糖的胰島，其差異表現基因更多是通道蛋白相關，特別是與 potassium channel、sodium channel 以及 β 細胞 membrane depolarization 有關的基因。這些基因改變會直接影響 β 細胞電生理興奮性與持續性 insulin secretion，因此與 C1、C3 的第二相分泌下降相吻合。

發育期高糖暴露相關基因包括 KCNIP1、KCNQ2、SLC2A2、SLC18A2、SLC24A3、FXYD2、GAS6、PTPN21、TPRN、PLPPR4、FSTL5、LMX1A 等。這組訊號偏向 ion transport、channel activity、membrane excitability 與 depolarization machinery，與第二相 insulin secretion 的持續性缺陷具有功能連結。

這個轉錄體結果強化了前面的 GSIS 功能觀察：成熟期高糖與發育期高糖並不是同一種壓力在不同時間出現而已，而是觸發不同分子程式，進而造成不同相位的胰島素分泌障礙。

SLC2A2 / GLUT2 範例：發育期高糖造成可持續維持的轉錄與染色質變化

為了說明發育期高糖所造成的分子變化可能具有持久性，研究者特別以 SLC2A2 為例。SLC2A2 編碼 GLUT2，講者將其描述為 pancreatic β cells 中主要的 glucose transporter，也是重要的 glucose sensor。

當 developing pancreatic progenitors 暴露於高糖時，在 day 20 immature islets 中可觀察到 GLUT2 / SLC2A2 下調。表觀遺傳分析也與此一致：ATAC-seq 顯示 SLC2A2 gene region 的 chromatin accessibility 降低，表示該基因區域較不開放，與轉錄下調相符。

更重要的是，即使後續移除高糖刺激，這個 SLC2A2 下調仍然維持。也就是說，如果在發育期暴露於高糖，之後成熟期改回低糖，SLC2A2 表現仍低於全程低糖參考組。這種變化在胰島維持更長培養時間後仍可見，顯示早期發育期間受到的高糖訊號可能轉化為穩定的基因調控狀態。

SLC2A2 分析包含 day 20 immature islets 與 day 34 mature islets，並進一步追蹤至 day 41 mature islets。比較條件可表示為 LG-LG、LG-HG、HG-LG、HG-HG，其中 LG 為 low glucose、HG 為 high glucose。即使從 HG 發育條件轉回 LG 成熟條件，SLC2A2 relative expression 仍維持下降；SLC2A2 gene region 也呈現較低 chromatin accessibility。顯著性標示包括 * adjusted P < 0.05、 adjusted P < 0.001、* adjusted P < 0.0001。

因此，SLC2A2 / GLUT2 的例子說明一個關鍵概念：發育期的高糖暴露不只是造成短暫的 glucose response，而可能透過染色質可近性與轉錄程式改變，在胰島細胞中留下穩定記憶。

這提供了一個可能的機制模型來解釋流行病學觀察：母體糖尿病造成的子宮內高糖暴露，可能在胎兒胰島發育期間重塑 β 細胞與胰島細胞的轉錄／表觀遺傳狀態，進而讓子代在尚未發病前就具有較低的 insulin secretory response，並增加未來第 2 型糖尿病風險。

結論：早期高糖暴露可能穩定重塑胰島功能，影響子代糖尿病易感性

本研究利用 Indigenous American iPSC-derived pancreatic islets 作為模型，分別模擬發育期與成熟期高糖暴露，得到幾個核心結論：

母體妊娠期間糖尿病與子代第 2 型糖尿病高風險密切相關，尤其在 Indigenous Americans 中是重要公共健康問題。
iPSC-derived SC-islets 可作為研究人類胰島發育與葡萄糖暴露效應的模型，因為它能從 pancreatic progenitor 逐步成熟為具有 GSIS 的 mature islets。
高糖暴露對胰島組成的影響很小，β 細胞比例、total insulin content、proinsulin/insulin ratio 都不能完全解釋功能差異。
高糖暴露時間窗決定分泌缺陷型態：
- 成熟期高糖主要降低第一相 insulin secretion；
- 發育期高糖主要降低第二相 insulin secretion；
- 全程高糖則同時影響第一相與第二相。
轉錄體變化與功能缺陷相互對應：
- 成熟期高糖誘發急性 glucose-response genes 與第一相分泌相關基因；
- 發育期高糖影響 channel proteins 與 depolarization machinery，對應第二相分泌缺陷。
發育期高糖造成的變化可在移除高糖後維持，SLC2A2 / GLUT2 下調與 chromatin accessibility 降低提供了具體例證。

講者最後指出，這些早期發育階段產生並可穩定維持的變化，可能影響後代胰島功能與糖尿病易感性。

致謝對象包括 sample donors、Divya、Jeff、Koushik、Dr. Leslie Baier、Dr. Clifton Bogardus，以及 NIDDK Intramural Research Program。

討論與問答

問題 1：不同 endocrine cell composition 是否影響 insulin secretion？

第一個問題來自 Vanderbilt University 的 Marcel Bursau。問題聚焦在 stem-cell-derived islets 的細胞組成：除了 β 細胞之外，是否有分析其他 endocrine cell types？因為不同 endocrine cell differentiation 本身可能影響偵測到的 hormone secretory patterns，尤其是透過 intra-islet paracrine interactions 影響 β 細胞胰島素分泌。

回答中說明，正式簡報中因時間限制只展示了 insulin 與 NKX6.1 標記的 β 細胞比例，但研究團隊其實也分析過其他內分泌細胞，例如 alpha cells、delta cells 等。講者同意 paracrine interactions 的概念，但根據目前經驗，alpha cell 數量差異並沒有大到足以直接解釋 insulin secretion 的差異。即使是 β 細胞比例，四種條件間差異也小於 5%。

追問中提到，提問者自己的研究曾看到 delta cells 對 insulin secretory output 有強烈影響，因此想更了解此模型生成的 delta cell 情況。講者表示可以會後進一步討論。

問題 2：人類 β 細胞主要 glucose transporter 是 GLUT1 還是 GLUT2？

接著來自 Boston 的 Kulkarni 提出問題，指出他對 glucose transporter 的說法感到困惑：在人類 β 細胞中，通常認為 GLUT1 是主要 transporter，而 GLUT2 在 rodent β cells 中才是主要 glucose sensor/transporter。

講者回應時重申，GLUT2 是 pancreatic β cells 中的 glucose sensor，具有 high Km、low affinity 的特性；GLUT1 則存在於其他多種細胞類型。依講者說法，在 pancreatic β cells 中 GLUT2 是主要 transporter / glucose sensor。

這段問答反映出 SLC2A2 / GLUT2 在人類 β 細胞中的詮釋仍可能引發討論，但在本研究的邏輯中，SLC2A2 被用作一個發育期高糖導致 glucose-sensing machinery 及 chromatin state 改變的代表性例子。

問題 3：iPSC clonal variability 是否可能解釋小幅 β 細胞比例差異？

同一位提問者接著詢問 iPSC clone variability。由於 iPSC 之間本來就可能存在 clonal variability，而研究中 β 細胞比例差異約 4.8% 左右，這樣的小差異是否可能只是 clone 間變異造成？

回答中指出，clonal variability 確實可能影響 islet composition；但本研究的四種條件比較並不是把不同 iPSC lines 直接互相比，而是從同一條 iPSC line 衍生出的同一批 pancreatic progenitors，再分成四種 glucose exposure conditions。因此主要比較是在同一 genetic/clonal background 內比較不同處理條件，而非不同 iPSC line 之間的差異。

問題 4：培養基中是否含有外源性 insulin？

最後一個問題來自 University of British Columbia 的 Janelle Cobb。她詢問，在後期培養階段的培養基中是否含有 insulin，因為如果培養基本身含 insulin，會影響 hormone content 或 secretion assay 的解讀。

講者回答：沒有。培養基中沒有外加 insulin；實驗中測得的 insulin 來自培養產生的實際 β cells。

Take-home Summary

研究問題：母體妊娠期間糖尿病是否透過子宮內高糖暴露，重塑胎兒胰島／β 細胞發育，導致子代較高第 2 型糖尿病風險？
模型：以 Indigenous American iPSC-derived pancreatic islets 模擬人類胰島發育，並分別在發育期與成熟期施加 5.5 mM 或 25 mM glucose。
關鍵設計：A1 為全程低糖參考組；A3 為成熟期高糖；C1 為發育期高糖；C3 為全程高糖。
細胞組成：四組皆能形成相當比例 INS/NKX6.1 雙陽性的功能性 β 細胞；β 細胞比例差異小於 5%，insulin content 與 proinsulin/insulin ratio 無顯著差異。
功能結果：
- 成熟期高糖 → 第一相 insulin secretion 下降；
- 發育期高糖 → 第二相 insulin secretion 下降；
- 發育期與成熟期皆高糖 → 第一相與第二相皆下降。
分子機制：
- 成熟期高糖誘發急性 glucose-response genes，如 TXNIP、RGS16、RBPMS2，並涉及 DMBT1、NOTUM、ATOH8 等第一相分泌相關基因；
- 發育期高糖影響 channel proteins、membrane depolarization 相關基因，對應第二相分泌缺陷。
持久性改變：SLC2A2 / GLUT2 在發育期高糖後下調，且伴隨 chromatin accessibility 降低；即使移除高糖刺激，表現下降仍可維持至成熟胰島階段。
核心結論：子宮內高糖暴露可能在胰島發育過程中建立穩定的轉錄與表觀遺傳狀態，造成子代 β 細胞分泌功能缺陷，進而提高未來第 2 型糖尿病易感性。