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Expanding the Target Space for DKD: A Multiplexed Characterization of AAV Cellular Tropism Targeting Tubular Epithelial Cells for High Throughput In Vivo Perturb-seq
ADA2026

Expanding the Target Space for DKD: A Multiplexed Characterization of AAV Cellular Tropism Targeting Tubular Epithelial Cells for High Throughput In Vivo Perturb-seq

2026-06-05

Expanding the Target Space for DKD: A Multiplexed Characterization of AAV Cellular Tropism Targeting Tubular Epithelial Cells for High Throughput In Vivo Perturb-seq

演講者：Gavin Pharaoh, PhD (Gordian Biotechnology 資深科學家)

慢性腎臟病（CKD）藥物研發的瓶頸與體內功能基因體學的興起

在體學技術（Omics）高速進步與大規模數據集爆發的時代，科學家已經發現了大量與複雜疾病相關的潛在基因靶點，但這些基因與疾病之間的因果關係（Causal relationships）大多仍屬未知。

傳統上，要驗證這些基因靶點的重要性，必須在相關的慢性腎臟病（CKD）動物模型中進行單一基因的體內（In vivo）功能驗證。然而，這種一次只能驗證一個靶點的方法，特別是在需要與現有藥物進行聯合治療（Combination therapies）的評估時，已成為延遲新藥開發的主要瓶頸。要真正識別出 CKD 的致病靶點，科學家需要一種能夠在疾病相關模型中進行大規模、具可擴展性（Scalable）的體內測試平台。

Slides 延伸補充：根據 Susztak 實驗室的大規模 eGFRcrea GWAS 元分析（Meta-analysis, N = 2,287,877），目前已發現 99,595 個顯著變異位點與 1,026 個獨立基因座（其中 97 個為新發現）。面對如此龐大的候選靶點，傳統的單一驗證方式完全無法應付。

為了突破這一瓶頸，Gordian Biotechnology 開發了一套體內混合馬賽克篩選（In Vivo Pooled Mosaic Screening）平台，利用體內功能基因體學（In vivo functional genomics）技術，在單一動物體內同時測試數百種藥物靶點假設：

  1. 構建 AAV 庫（AAV Library）： 首先建立一個腺相關病毒（AAV）載體庫，每個載體針對一個特定的目標基因，進行過度表達（Overexpression）、敲低（Knockdown）或敲除（Knockout）。
  2. 體內注射與馬賽克表達： 將此混合庫注射到最具臨床轉譯價值的複雜疾病動物模型中。這會在動物體內創造出「馬賽克式（Mosaic）」的表達模式——大多數細胞不會受到任何干預，而受感染的細胞通常只會接受單一基因的擾動（Perturbation）。
  3. 單細胞定序讀取： 利用單細胞/單核 RNA 定序（scRNA-seq / snRNA-seq）技術分析組織，評估這些基因擾動對疾病相關病理通路的影響。
  4. 靶點優先化與驗證： 根據其對廣泛疾病生物學的影響，篩選出最優質的藥物靶點，並使用傳統的單一靶點驗證實驗（過度表達或功能喪失研究）進行後續確認。

解決細胞特異性遞送難題：AAV 趨向性（Tropism）篩選

要成功應用此平台，首要解決的是細胞特異性遞送（Cell-type-specific delivery）的問題，必須確保載體能精準送達目標細胞（例如腎小管上皮細胞）。

Gordian 採用了類似的混合篩選邏輯來解決此問題：

  • 將帶有條碼（Barcoded）的 AAV 血清型（Serotypes）混合庫注射到 CKD 動物模型中。
  • 利用單細胞分析技術，根據細胞內定序到的條碼，鑑定出哪些 AAV 血清型能最有效率地遞送到特定的目標細胞類型。

Slides 延伸補充：利用單細胞定序，研究團隊能精確區分腎臟內的多種細胞群，包括近端小管（Proximal tubule）、遠端與連接小管（Distal and connecting tubule）、集尿管主細胞與閏細胞（Collecting duct principal & intercalated cells）、亨氏環粗段與細段（Loop of Henle thick & thin segments）、足細胞（Podocytes）、內皮細胞（Endothelial cells）及間質細胞（Mesenchymal cells）等，並繪製出不同 AAV 血清型對這些細胞的特異性轉導熱圖。

Gordian 目前擁有多種能模擬人類不同共病表型與疾病嚴重度（以腎小球濾過率 GFR 下降程度評估）的慢性腎臟病與糖尿病腎病變（DKD）動物模型，包括：

  • 自由選擇飲食倉鼠模型（Free-choice hamsters）： 模擬肥胖與代謝異常。
  • 腺嘌呤飲食小鼠模型（Adenine-diet mice）： 嚴重的腎小管間質纖維化模型。
  • ZSF1 肥胖大鼠模型（ZSF1 obese rat model）： 具備多種代謝共病。
  • 5/6 腎切除大鼠模型（5/6 nephrectomy rat model）： 經典的殘餘腎功能不全模型。

Slides 延伸補充：在疾病嚴重度上，以健康對照組的 GFR 為基準，10 週齡的 ZSF1 肥胖大鼠 GFR 上升了 24%（呈現早期高濾過狀態）；而 10 週齡單側腎切除（Unx）的 ZSF1 肥胖大鼠 GFR 下降 20%；7 週齡的 5/6 腎切除大鼠 GFR 下降 58%；而進行 3 週 0.2% 腺嘌呤飲食的小鼠，其 GFR 則大幅下降了 77%。

應用實例一：在倉鼠 DKD 模型中優化載體遞送

研究團隊首先在 10 週齡的雄性倉鼠中建立自由選擇飲食（Free-choice diet）模型，讓倉鼠自主選擇攝取高脂高糖飲食或常規飼料（Regular chow）。

經過長期餵食後，這些倉鼠發展出顯著的糖尿病腎病變特徵：

  • 糖穩態受損（空腹血糖顯著升高，p = 0.0131）。
  • 腎功能受損：腎小球濾過率（GFR）顯著下降（p = 0.0025），且血清胱甘肽酶 C（Serum Cystatin C）顯著上升（p = 0.0070）。

在表型穩定後（約第 29-30 週），研究團隊向倉鼠注射了包含 13 種 AAV 血清型的條碼庫，並於第 32 週進行單核 RNA 定序（snRNA-seq）。

實驗結果： 透過單細胞轉錄組分析，研究團隊成功鑑定出數種能高效靶向腎臟關鍵細胞的新型 AAV 血清型：

  • 近端小管上皮細胞（Proximal tubule epithelial cells）： 成功篩選出 AAV-KP1、AAV-DJ9 以及 AAV-DJ。
  • 纖維母細胞與周細胞（Fibroblasts and pericytes）： 同樣實現了高效轉導。 這些篩選出的優勢血清型隨後被應用於其他 CKD 模型的治療篩選中。

應用實例二：腺嘌呤飲食小鼠模型與體內概念驗證（PoC）篩選

研究團隊進一步將篩選出的 AAV 血清型應用於 0.2% 腺嘌呤飲食（Adenine-diet）小鼠模型中。

1. 模型特性與標準治療（SGLT2 抑制劑）的評估

首先，團隊評估了該模型在給予 SGLT2 抑制劑——恩格列淨（Empagliflozin, Empa, 30 mg/kg/day）治療下的表現：

  • 恩格列淨治療顯著延緩了小鼠的體重減輕，並部分維持了 GFR（相較於未治療的腺嘌呤組，GFR 顯著回升，p = 0.0002）。
  • 然而，接受恩格列淨治療的小鼠最終仍會進展至終末期腎衰竭。這與臨床上 CKD 患者在接受標準治療後僅能延緩、但無法完全阻止疾病進展的現狀高度一致。
  • 在細胞組成變化上，腺嘌呤飲食會導致免疫細胞浸潤增加、近端小管細胞減少；在去除免疫細胞干擾後，可觀察到纖維母細胞與周細胞的比例顯著增加。而 AAV 成功轉導了包括近端小管、纖維母細胞及周細胞在內的關鍵細胞群。

2. 在標準治療背景下進行體內概念驗證（PoC）敲除篩選

為了尋找能與 SGLT2 抑制劑產生協同效應（Synergy）的潛在療法，研究團隊在 H11-SpCas9 轉基因小鼠上進行了體內概念驗證篩選。小鼠在接受腺嘌呤飲食與恩格列淨治療的背景下，注射了針對多種臨床試驗藥物靶點與陽性對照基因的 AAV 庫。

Slides 延伸補充：篩選的靶點基因涵蓋多個關鍵生物學類別：

  • 臨床試驗陽性靶點（Positive Clinical trial）： Slc5a2 (SGLT2), Nr3c2 (MR), Ednra (ETA)
  • 代謝（Metabolism）： Ppara, Khk
  • 鐵死亡與氧化還原（Ferroptosis & Redox）： Keap1, Gpx4, Acsl4
  • 發炎（Inflammation）： Jak1, Angpt2, Ctnnb1 (β-catenin)
  • 臨床試驗陰性靶點（Negative Clinical trial）： Map3k5 (ASK1), Aoc3
  • 基因體關聯研究靶點（GWAS）： Nat8, Gatm

3. 體內精準敲除與通路效應分析

研究團隊針對每個靶點設計了 3 個使用不同引導 RNA（gRNA）的獨立 AAV 構築體，並重點分析了周細胞與纖維母細胞的數據：

  • 精準靶向敲低確認： 實驗證實，目標基因的表達量出現了 -1 至 -3 的 log2 倍數變化（Log2 fold change），相當於 mRNA 表達量減少了 50% 至 85%，證實了體內 CRISPR 剪切的高效性。
  • 生物通路調控效應： 藉由直接分析來自疾病環境中細胞的轉錄組，研究團隊觀察到：
    • 對照組（Inert controls）： 對轉錄組幾乎沒有影響，證實了平台的特異性。
    • Keap1 敲除（Keap1 KO）： Keap1 是 Nrf2 轉錄因子的抑制劑。敲除 Keap1 後，細胞內如預期般激活了 Nrf2 信號通路、活性氧（ROS）解毒防禦通路以及氧化磷酸化通路。
    • Jak1 敲除（Jak1 KO）： Jak1 是發炎反應的重要調節劑。敲除後，顯著抑制了 JAK-STAT 信號通路及其他促炎信號通路。
    • Ctnnb1 敲除（Ctnnb1 KO）： 成功降低了 Wnt 信號通路，但同時也觀察到纖維化反應的加劇。這顯示體內擾動定序（In vivo perturb-seq）能提供全面且真實的生物學回饋，避免單一指標的偏誤。

這些結果證實，該平台不僅能在標準治療背景下成功遞送並敲除目標基因，還能精確評估基因缺失對複雜體內微環境中細胞轉錄組的影響，為尋找協同治療靶點提供了強大工具。

應用實例三：轉譯至複雜代謝性 DKD 大鼠模型（進行中項目）

研究團隊目前正將此篩選平台轉譯至更具臨床相關性的複雜代謝性 DKD 模型——ZSF1 肥胖大鼠（ZSF1 Obese Rat）。

該模型能高度模擬人類的臨床共病，包括：

  • 肥胖、高血糖、高血壓。
  • 射血分數保留的心力衰竭（HFpEF）。
  • 漸進性 GFR 下降與尿白蛋白/肌酸酐比值（UACR）升高。

實驗設計與進展：

  • 大鼠在出生後 10 週接受單側腎切除手術（Unx）以加速腎病進展。
  • 隨後給予臨床最常見的聯合標準治療：SGLT2 抑制劑（恩格列淨 Empagliflozin）與 RAAS 抑制劑（賴諾普利 Lisinopril），成功觀察到 UACR 的治療性下降。
  • 在第 24 週（標準治療背景下）注射 AAV 混合庫，並計劃於第 28 週進行單細胞定序分析。
  • 篩選目標： 尋找在對照組（Vehicle）中能提供「完全保護（Total protection）」的靶點，以及在標準治療組中能產生「協同效應（Synergistic）」的新穎靶點。

平台於心腎代謝（CRM）領域的大規模驗證

除了腎臟疾病，Gordian 團隊已在心腎代謝（CRM）領域的其他關鍵組織中完成了大規模的體內篩選，並已進入靶點驗證階段：

  • 肥胖症篩選（Obesity）： 在高脂飲食誘導的肥胖（DIO）小鼠模型中進行脂肪細胞篩選。發現的新型靶點（如 Augury1）與司美格魯肽（Semaglutide）聯用時，展現出強大的協同減重效果（體重減輕達 20.3%，而單用司美格魯肽組僅減輕 12.6%）。
  • HFpEF 篩選： 在 ZSF1 肥胖大鼠的心肌細胞中進行篩選。驗證的新型靶點顯著改善了心臟舒張功能，包括縮短心室舒張時間常數（Tau）並降低左心室舒張末期壓力（LVEDP），這些均是臨床診斷人類心臟衰竭的金標準指標。

Take-home Summary

  1. 突破體內驗證瓶頸： Gordian 的體內混合馬賽克篩選平台（In Vivo Perturb-seq）成功解決了傳統單一基因驗證效率低下的問題，實現了在單一動物體內同時對數百個基因靶點進行高通量的功能驗證。
  2. 精確的細胞靶向遞送： 透過帶有條碼的 AAV 血清型篩選，成功在倉鼠與小鼠模型中鑑定出能高效、特異性轉導腎小管上皮細胞、纖維母細胞與周細胞的載體（如 AAV-KP1, AAV-DJ9, AAV-DJ）。
  3. 標準治療背景下的協同篩選： 該平台能在現有標準治療（如 SGLT2i、RAASi）的背景下運作，這對於尋找能與現有臨床一線藥物產生協同效應、提供額外療效的新一代藥物靶點至關重要。
  4. 多器官 CRM 平台的建立： 該技術已成功應用於心臟（HFpEF）、腎臟（CKD/DKD）及脂肪組織（Obesity），並已有多個靶點在動物實驗中證實了與臨床一線藥物（如 GLP-1 受體激動劑）聯用的協同療效。