Extracellular Vesicle Proteomics Distinguishes Partial Clinical Remission in New-Onset Type 1 Diabetes

開場與研究問題：以 EV proteomics 捕捉新發病 T1D 的「緩解生物學」

Dr. Anika Bilal 以「extracellular vesicle proteomics distinguishes partial clinical remission in new-onset type 1 diabetes」為題，介紹一項針對新發病第 1 型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）青少年之縱向研究。她先說明自己前一晚開始高燒且有些暈眩，若演講中有口誤請聽眾見諒；並揭露無利益衝突。
研究團隊包括 Anika Bilal、Yury O. Nunez Lopez、Alejandra M. Petrilli、Konda Reddy、Krystal Irizary、Jamie Cruz、Kory Grench、Richard E. Pratley 與 Anna Casu，機構為 AdventHealth。

本演講的核心問題是：在新診斷 T1D 後，有些兒童與青少年會進入 partial clinical remission（PCR），也就是俗稱的 honeymoon phase，代表仍有一定程度的 β cell function 被保留。若能在疾病初期辨識哪些患者會進入或不會進入 PCR，將有助於選擇與時機化疾病修飾治療（disease-modifying interventions），以保存 β cell function。Dr. Bilal 的研究嘗試以 extracellular vesicles（EVs） 的蛋白質體訊號來區分 remission 與 non-remission 狀態，並探索其診斷與預測價值。

Extracellular vesicles：穩定循環中的疾病生物學「即時快照」

Extracellular vesicles（EVs） 是細胞釋放到 extracellular space 的 membrane-bound nanovesicles。EVs 主要可分為三類：

Apoptotic bodies：與細胞死亡相關的大型 vesicles。
其大小約 500 nm–5 μm，常含有 cellular fragments、DNA 與 organelles，較偏向 apoptosis 相關產物，而非典型 intracellular signaling vesicles。
Exosomes：由 endosomal pathway 形成的 small intraluminal vesicles。
典型大小約 30–150 nm，來自 early endosome / multivesicular body 路徑，並可透過 exocytosis 釋放；其結構穩定，具備 target intercellular communication 的能力。
Microvesicles：由 plasma membrane outward budding 形成。
典型大小約 100–1000 nm，可攜帶 proteins、RNAs、lipids 與 nucleic acids，透過分子貨物轉移參與細胞間溝通。

EVs 的關鍵價值不只是 vesicle 本身，而是其 cargo：它們攜帶 proteins、RNAs、lipids 等分子，能反映來源細胞當下的 physiological state。因此，EVs 在 intercellular communication 與 interorgan communication 中具有重要角色，也具備作為 biomarkers 與 therapeutic tools 的潛力。
EVs 也被視為可能的 therapeutic delivery vehicle，例如運送 RNAs 或 proteins；此概念來自 EVs 的天然穩定性與細胞間訊息傳遞能力。

在 T1D 這類慢性免疫代謝疾病中，EVs 因為在循環中相對穩定，可以提供一種 real-time、minimally invasive snapshot，讓研究者在不直接取得胰島組織的情況下，觀察疾病 biology 的變化。

T1D 進展與 partial clinical remission：β cell function 保存的短暫治療窗口

T1D 的進展可被視為一個連續過程：從 genetic predisposition 與 environmental risk factors 開始，接著出現 islet autoantibodies，之後發生 abnormal blood glucose 與 hyperglycemia，最後進入 clinical diagnosis 與 insulin dependence。整個過程中，β cell function 逐步喪失。

疾病進展常可對應到 T1D staging：Stage 1 為 ≥2 autoantibodies 但 euglycemia、無症狀；Stage 2 為 abnormal blood glucose 但仍可無症狀；Stage 3 為 symptomatic T1D，通常開始 insulin therapy。圖示中也強調 insulin release 從正常逐步下降，functional β-cell mass 隨時間下降。

Partial clinical remission phase（PCR），也稱 honeymoon phase，是臨床診斷 T1D 後短暫出現的 preserved β cell function 時期。約 50% 的兒童會經歷 PCR。這段期間格外重要，因為它是疾病修飾介入以保存 β cell function 的關鍵治療窗口。

PCR 的標準定義之一是 insulin dose-adjusted A1C（IDAA1c）≤ 9，且此指標與 stimulated C-peptide > 300 pmol/L 有良好相關。
IDAA1c 公式為：HbA1c (%) + 4 × insulin dose (U/kg/24 h) ≤ 9；此定義與 Mortensen 等 Diabetes Care 2009 研究相關，並在近年 T1D remission 文獻中持續被引用。

HONEY Study：縱向追蹤新發病 T1D 青少年 EV cargo 與 remission 狀態

Dr. Bilal 介紹的研究稱為 HONEY Study，有兩個主要目標：

Longitudinally characterize extracellular vesicles and their cargo，包括 proteins 與 nucleic acids，對象為新發病 T1D 青少年。
評估 EV proteomic signatures 在 T1D remission 中的 diagnostic 與 predictive potential。

這是一項約 6 個月的縱向研究，共納入 10 位 12–18 歲新診斷 T1D 青少年。Visit 1 發生於 T1D 診斷後 3 個月內。之後每 2 週評估是否進入 PCR；研究中以 total daily dose（TDD）< 0.3 units/kg/day 作為實務上的 remission 判定指標。Visit 2 的時間依 remission status 而不同：若是 non-remitters，Visit 2 在 Visit 1 後 3 個月進行；所有參與者皆有 Visit 3，時間為 Visit 2 後 3 個月。研究也納入一組 well-balanced healthy cohort 作為 baseline comparison。每次 visit 皆收集 blood 與 urine。
TDD < 0.3 units/kg/day 作為 PCR 實務判定標準，投影片引用 Lundberg 與 Marino 2017 年 J Pediatr Endocrinol Metab 研究，該研究比較此 TDD 門檻與 IDAA1c < 9 gold standard 對 PCR 偵測的準確性。

納入條件包括：

年齡 12–18 歲；
依 ADA criteria 診斷 T1D；
急性發病；
存在 islet-associated autoantibody；
診斷至納入時間 ≤ 3 個月。

排除條件包括：

第 2 型糖尿病病史；
懷疑非 T1D；
癌症、器官移植、HIV、active hepatitis B/C、TB 病史或狀態；
使用 insulin 以外的 antihyperglycemic agents。

在 10 位 T1D 參與者中，Visit 2 時有 4 位 remitters、6 位 non-remitters。雖然 cohort 很小，但臨床表徵清楚，且組間沒有顯著差異。
基線表格顯示參與者年齡約 13.5–14.7 歲，男性比例約 33–50%；T1D remission 與 non-remission 組的 HbA1c 約落在 7.5–8.2% 範圍，健康對照約 5.13%；空腹 C-peptide 約 0.35–0.57 nmol/L。資料以 mean ± SD 或 n(%) 呈現。

EV 分離、表徵與 SomaScan 11K proteomics workflow

研究流程先從血液樣本中分離 platelet-free plasma，再從 plasma 中分離 EVs。EV characterization 使用：

Nanoparticle tracking analysis（NTA）
Transmission electron microscopy（TEM）
Capillary Western 驗證 classical exosomal markers

之後使用 SomaScan 進行蛋白質體分析，profiling 約 11,000 proteins。SomaScan 使用 aptamer technology。資料分析包括 differential expression analysis 與 machine learning models。
實驗設計中，EV proteomics 使用約 1 mL platelet-free plasma；EV isolation 採 Norgen Plasma/Serum Exosome Purification Mini Kit；蛋白質體檢測為 SomaScan 11K Assay（Somalogic, aptamer technology）；資料分析流程包含 QC、differential expression analysis 與 machine learning models。

EV preparation 顯示樣本富集於 small vesicles。TEM 影像呈現 EV morphology；NTA 顯示 EV 的 size distribution 與 concentration。Capillary Western 驗證 exosomal markers，包括 CD9、CD81、TSG101。
NTA 的 merged data 顯示平均粒徑約 179.2 nm，mode 約 111.8 nm，D50 約 151.7 nm，D90 約 279.8 nm；粒子濃度約 2.88 × 10^10 ± 3.31 × 10^9 particles/mL。Capillary Western 亦包含 Flotillin-1 作為 EV-associated marker。

SomaLogic proteomics 在 EV fractions 中辨識出 超過 6,000 個 EV proteins，其中超過 50% 與 ExoCarta 重疊。ExoCarta 是 exosomal cargo 的資料庫，因此這個重疊支持研究所分離出的 vesicles 與 exosomal cargo 有相當程度一致性。
ExoCarta comparison 顯示 SomaScan 偵測到的 EV protein set 與既有 exosomal cargo database 有大量重疊，強化 EV preparation 與 proteomic profiling 的可信度。

EV proteomics 在不同 cohort 間呈現差異：疾病狀態與 remission biology

接著 Dr. Bilal 展示 EV proteomics 在不同 cohort 之間的差異。第一個比較是 non-remitters vs healthy controls，differential expression analysis 找到 206 個顯著差異的 EV proteins。第二個比較是 non-remitters vs remitters，在 Visit 2 找到 184 個 differentially expressed EV proteins。

這些結果說明 EV cargo 不只反映 T1D disease state，也反映 remission biology。換句話說，EV proteomics 可能同時捕捉到「是否患病」與「疾病進程中是否進入保留 β cell function 的狀態」這兩層資訊。
Differential expression 的篩選標準為 fold change > 1.2、P < 0.05、FDR < 0.2；火山圖中同時呈現 p value 與 log2 fold change。

這一點對 T1D 臨床轉譯尤其重要：若 EV cargo 能在早期反映 remission biology，它可能成為篩選高風險 non-remitters、或選擇適合 disease-modifying therapies 患者的工具。

Exocrine pancreatic markers：trypsinogen 與 lipase 的訊號

Dr. Bilal 進一步討論 trypsinogen 與 lipase。這兩者是 exocrine pancreatic function 的 markers，也被認為可區分會進展至 T1D 的個體。

在本研究中，trypsinogen expression 在 healthy controls 與 new-onset T1D 之間顯著不同，但在 remitters 與 non-remitters 之間沒有差異。因此，trypsinogen 可能較能反映 T1D disease state，而不一定能區分 remission status。

相對地，lipase expression 雖未在該圖中呈現，但在 Visit 2 時，remitters 與 non-remitters 之間有顯著差異。這暗示 exocrine pancreatic signatures 也可能參與或反映 remission biology。
相關背景引用 Williams, Grace 等人 2025 年 BMJ Open Diabetes Research & Care 研究，指出 trypsinogen 與 lipase 作為 exocrine pancreatic function markers，可幫助辨識進展至 T1D 的個體。

IgA：non-remitters 中升高，指向 mucosal immune dysregulation

T1D 中，增加的 mucosal IgA response 與 β cell autoimmunity 有關。本研究發現 IgA expression 在 non-remitters vs controls 中顯著升高；同時，non-remitters 相較於 remitters 也呈現 IgA expression 增加的趨勢。

這與越來越多證據相符：T1D 不只是胰島局部自身免疫疾病，也涉及 mucosal immune dysregulation。較高的 IgA 可能代表更活躍或較不利的免疫環境（active or unfavorable immune environment），也可能與較差的 β cell preservation 有關。
投影片引用 Huang 等 JCEM 2020 與 Huang/Pearson 等 JCI Insight 2020，支持 mucosal IgA response 與 β-cell autoimmunity 的關聯。

此結果的生物學意義在於，EV-associated IgA 可能作為一種免疫狀態 readout：non-remitters 的 EV cargo 中若帶有較強 IgA 訊號，可能反映其免疫系統仍處於較活躍、較發炎或較自體免疫驅動的狀態，使 β cell function 較難被保留。

FCGRA / CD16a：remitters 中升高，可能代表較受調控或保護性的免疫狀態

另一個重要訊號是 FCG receptor 3A，也就是 FCGRA（Fc gamma receptor IIIa, CD16a）。FCGRA 通常表現在 NK cells、macrophages、monocytes 上，能結合含 IgG 的 immune complexes，並參與 immune complex clearance。

在本研究中，FCGRA expression 在 remitters 中高於 non-remitters。Dr. Bilal 解釋，這可能代表 remitters 具有較受調控或較保護性的免疫狀態。
FCGRA/CD16a 可結合 IgG-containing immune complexes，並可能協助 immune complex clearance，例如 autoantibody-containing immune complexes 的清除；相關背景引用 Thaler/Bublitz 等 Frontiers in Immunology 2025 與 Pant 等 Science Advances 2024。

從 IgA 與 FCGRA 的對比來看，non-remitters 似乎有較高的 mucosal/autoimmune activation 訊號，而 remitters 則可能有較佳的 immune complex handling 或 immune regulation。這也支持 EV proteomics 不只是疾病診斷工具，而可能揭示 remission 相關免疫機制。

KEGG pathway enrichment：non-remitters 呈現更強免疫與發炎路徑

KEGG pathway enrichment analysis 進一步支持上述結果。與 healthy controls 相比，non-remitters 顯示 immune 與 inflammation-related pathways 的 enrichment，包括：

Hematopoietic cell lineage
Cytokine signaling
JAK-STAT signaling pathway

而與 remitters 相比，non-remitters 尤其顯示 cytokine signaling 增強，凸顯 non-remitters 具有更活躍的 inflammatory profile。
路徑分析以 normalized enrichment score（NES）呈現；除上述免疫/發炎路徑外，non-remitters vs healthy controls 也出現 axon guidance enrichment 訊號。

這些 pathway-level findings 與個別蛋白質結果互相呼應：non-remitters 的 EV cargo 呈現免疫活化、cytokine signaling 與 inflammatory pathway 的強化；remitters 則可能有不同的免疫調節特徵，使其在診斷後仍保留較多 β cell function。

Baseline 14-protein EV panel：以 random forest 預測 remitters 與 non-remitters

最關鍵的結果之一是 machine learning 分析。研究團隊使用 top 500 EV proteins 建立 random forest model，並發現一組 14 個 EV proteins 的 baseline panel 能區分 remitters 與 non-remitters，ROC curve / ROC-AUC 達 0.96。

Dr. Bilal 特別強調，這個結果仍需要更大 cohort 驗證；但即使在小型研究中，EV proteomics 已顯示出可觀的 predictive signal。這代表在疾病初期、甚至在 remission status 明確分化前，EV protein signatures 可能已經包含足以預測後續 remission trajectory 的資訊。

14 個 baseline EV proteins 包括 PLXNB2、SOGA3、TUFT1、USP30、IGFL4、CCDC50、RPL32、SDHAF4、SLC7A2、SVIP、PRXL2B、SIAH2、BBC3、NOVA1；random forest variable importance 顯示不同蛋白對分類模型的貢獻度。

這個 panel 的臨床意義在於：如果未來能在更大、更多樣族群中驗證，臨床上可能在 T1D 新診斷時就用 EV-based biomarkers 判斷患者是否較可能進入 honeymoon phase。這將有助於 stratify patients，並為保留 β cell function 的治療試驗提供更精準的入組與分層依據。

研究強項與限制

本研究的強項包括：

Longitudinal design：能沿著不同 disease courses 觀察 EV proteomics 的時間變化，而非只做單一時間點比較。
Comprehensive protein profiling：使用 SomaScan profiling 約 11,000 proteins。
Rigorous EV characterization：使用 NTA、TEM 與 Capillary Western 驗證 EV preparation。
Matched healthy controls：納入健康對照，使 disease state comparison 更穩健。
Novel focus：聚焦於 partial clinical remission phase 的 EV-based biomarkers，這是一個具有臨床轉譯潛力但仍相對新穎的研究方向。

限制則包括：

樣本數小，T1D participants 僅 10 人；
年齡範圍較窄，僅 12–18 歲；
單中心研究設計；
SomaScan 為 aptamer-based assay，proteomic findings 仍需 orthogonal validation。

這些限制意味著目前結果應被視為 hypothesis-generating 與 early-stage predictive signal，而非立即可用於臨床決策的 validated biomarker panel。下一步需要更大規模、多中心、年齡範圍更廣的 cohort，並以獨立方法驗證關鍵 proteins。

結論：EV proteomics 可辨識 T1D 早期 biomarkers 與 remission biology

Dr. Bilal 的結論有三點：

Extracellular vesicle proteomics 可以辨識 T1D 及其 partial remission 的早期 biomarkers。
Immune proteins，例如 IgA 與 FCGRA/CD16a，反映 remission biology。
一組 14 個 baseline EV proteins 的 panel 可區分 remitters 與 non-remitters。

她最後感謝患者與家屬，因為沒有他們就無法進行這類研究；也感謝 The Miller Foundation 提供經費支持，並感謝 mentors Richard Pratley 與 Anna Casu，以及 Yury Nunez Lopez 對本研究的關鍵貢獻。
聯絡資訊包含 yury.nunezlopez@adventhealth.com 與 anika.bilal@adventhealth.com。

問答重點：下一步、成本與臨床轉譯

下一步：更大 cohort 驗證與合作樣本

有聽眾詢問下一步是否會擴大族群、擴展年齡範圍並進行驗證。Dr. Bilal 回答，這確實是非常重要的 future direction。因為目前 cohort 很小，只有 10 位 participants，因此研究團隊非常希望在更大 cohort 中驗證這些 findings。

她也向在場聽眾提出合作邀請：如果有人手上有 newly diagnosed T1D participants 的樣本，且有興趣合作驗證 EV proteomics findings，可以與她或 Yury 聯繫。她強調，larger cohort validation 是讓這組 EV biomarker panel 走向臨床轉譯的必要步驟。

14 EV proteins assay 的成本

University of South Florida 的 Sam Wolf 詢問，如果要做 14 個 EV proteins 的 assay，粗略成本如何。Dr. Bilal 回答，整個 EV proteomics 是透過 SomaScan 完成，因此成本取決於 SomaScan 平台；她沒有立即記得完整費用，但指出這類分析確實昂貴。她也澄清，所謂 14 proteins 並不是一開始就單獨檢測 14 個，而是先透過 SomaScan 取得 EV proteomics 資料，再由 random forest model 從 EV proteins 中建立出 14-protein panel。

真實世界臨床應用：早期分層、預測 honeymoon phase、選擇 β cell preservation therapy

另一位聽眾詢問未來在 real-world clinical medicine 中的方向。Dr. Bilal 表示，如果這 14 個 EV proteins 能被驗證，潛力很大。臨床上若能在疾病剛開始時就辨識 biomarkers，就能預測哪些患者較可能進入 honeymoon phase、哪些患者不會進入。

這具有重要治療意義，因為目前已經存在一些可保存 β cell function 的藥物或介入策略。如果 baseline biomarkers 能指出某些患者具有較佳 β cell preservation 或較可能對藥物反應，臨床試驗與治療決策就可以更精準地選擇患者。最終目標是 identify the right patients：找出最可能受益於 disease-modifying therapies 的新診斷 T1D 患者，提升 β cell preservation strategy 的效率與成功率。

Take-home Summary

EVs 是穩定存在於循環中的 membrane-bound nanovesicles，其 cargo 可反映來源細胞與疾病狀態。
在 new-onset T1D 中，EV proteomics 可提供 minimally invasive、real-time disease biology snapshot。
PCR / honeymoon phase 是診斷後短暫保留 β cell function 的關鍵窗口，約 50% 兒童會經歷；IDAA1c ≤ 9 與 stimulated C-peptide > 300 pmol/L 相關。
HONEY Study 追蹤 10 位 12–18 歲新診斷 T1D 青少年，Visit 2 時有 4 位 remitters、6 位 non-remitters，並納入健康對照。
EV proteomics 在 non-remitters vs healthy controls 找到 206 個差異 EV proteins；在 non-remitters vs remitters 找到 184 個差異 EV proteins，顯示 EV cargo 同時反映 disease state 與 remission biology。
Trypsinogen 可區分 healthy 與 new-onset T1D，但不區分 remitters 與 non-remitters；lipase 在 Visit 2 可區分 remission status。
IgA 在 non-remitters 中升高，支持 T1D remission biology 與 mucosal immune dysregulation、自體免疫活性相關。
FCGRA/CD16a 在 remitters 中升高，可能代表較佳 immune complex clearance 或較受調控的免疫狀態。
KEGG pathway enrichment 顯示 non-remitters 有更強的 immune、cytokine 與 inflammatory signaling，尤其是 cytokine signaling。
Random forest model 從 baseline EV proteins 建立 14-protein panel，ROC-AUC 達 0.96，可區分 remitters 與 non-remitters；但仍需更大 cohort 與 orthogonal validation。
臨床轉譯目標是：在 T1D 診斷初期用 EV biomarkers 預測 honeymoon phase，進一步選擇最可能受益於 β cell function preservation therapies 的患者。