Modeling Immune Responses to Autologous and Allogeneic Human Stem Cell-Derived Islet Grafts in Vivo

講者：Giorgia Zanetti（Sykes lab, Columbia Center for Translational Immunology / Columbia Immunology）
主題：以人類免疫系統小鼠模型，研究自體與異體 human iPSC-derived islet grafts 的免疫反應，以及 islet antigen-reactive T cells 是否能浸潤自體胰島移植物。

研究背景：T1D、胰島移植限制與 iPSC-derived islets 的需求

第一型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）的核心病理是自體免疫破壞胰臟 β cells，進而造成 insulin deficiency。傳統胰島移植雖然可以改善 glycemic control，但臨床應用受到兩個重要限制：

供體胰島來源稀少；
需要終身免疫抑制治療，以避免移植物排斥。

因此，human iPSC-derived islets 成為很有吸引力的替代策略：它們理論上可以提供近乎無限的 β-cell source，並且可用於兩種不同移植情境：

Allogeneic transplantation：由他人來源的 stem cells / iPSCs 製備胰島；
Autologous transplantation：由與受者免疫系統同源的細胞來源製備胰島，以期降低排斥反應。

本研究的核心問題是：人類免疫系統在體內如何辨識並反應於 autologous 與 allogeneic human iPSC-derived islet grafts？此外，若將 T1D 病人中曾鑑定出的 islet antigen-reactive TCR 導入 T cells，這些 autoreactive T cells 是否會浸潤自體 iPSC-derived islet grafts，形成類似 T1D 的 autoimmune attack？

本研究題目聚焦在「in vivo modeling」，也就是不只在體外觀察 iPSC-derived β cells，而是建立可同時包含人類免疫系統與人類 stem-cell-derived islet graft 的小鼠平台，用於分析 graft infiltration、immune composition、endocrine cell survival/proliferation 與後續治療測試。

人類免疫系統小鼠模型與自體／異體 iPSC-derived islet graft 設計

研究團隊建立 human immune system mice。方法是使用去胸腺 NSG mice（thymectomized NSG mice），移植來自同一位 human fetal donor 的：

human fetal liver CD34+ hematopoietic progenitor cells；
human thymic tissue。

該 donor 的 HLA 型別為 HLA-A2、HLA-DR4、HLA-DQ8 positive。這樣的設計讓小鼠能在體內發育出人類免疫系統，包含 T cells、B cells、monocytes 等人類免疫細胞族群。

為了建立「免疫系統與移植物同源」的自體情境，團隊使用同一 fetal donor 的 CD34-negative fetal liver cells，將其 reprogram 成 iPSCs，接著再分化成 iPSC-derived islets。如此產生的 islet grafts 與小鼠體內重建的人類免疫系統來自同一 donor，構成 autologous / isogenic to immune system 的移植條件。

相對地，異體移植條件則使用無關成人 donor 的 fibroblasts 產生 iPSCs，再分化為 islets。這些 allogeneic islet grafts 與 human immune system mice 的免疫系統並非同源，因此可用來研究 human allogeneic immune responses。

整體實驗包含兩個使用相同 fetal donor 建立的人類免疫系統 mouse cohorts，並比較：

autologous iPSC-derived islet grafts；
allogeneic iPSC-derived islet grafts；
另有一個自體 graft subgroup 接受 islet antigen-reactive TCR-positive T cells 的 adoptive transfer，用來測試 autoreactive T cells 是否會浸潤自體胰島移植物。

這個設計的關鍵優點是：autologous grafts 與 immune system 共享 donor origin，可作為「理論上免疫相容」的基準；allogeneic grafts 則來自完全無關 donor，可作為 human alloimmune rejection 的模型。

人類免疫重建與 iPSC-to-β cell 分化品質

兩個 experimental cohorts 中的人類免疫系統小鼠都顯示出逐步的人類免疫細胞重建。整體而言，小鼠達到高程度 human chimerism，且能形成穩健的 T-cell development，同時在循環中也可偵測到 B cells 與 monocytes。

在 iPSC-to-β cell differentiation 方面，本研究共進行三次 iPSC-to-beta cell differentiation。分化完成時，至少約一半細胞表現 C-peptide，代表具有 insulin-producing β-like endocrine phenotype。進一步分析顯示，在 C-peptide-positive cells 中，大約 40% 同時表現 β-cell transcription factor NKX6.1。

移植後約六週，小鼠血中開始可偵測到 human C-peptide。原本預期 allogeneic grafts 可能因免疫攻擊而出現功能下降，但結果相反：三組小鼠的 circulating human C-peptide levels 都隨時間上升。後續分析顯示，in vivo C-peptide levels 與移植前 iPSC-to-β cell differentiation efficiency 高度相關；也就是說，移植物在體內產生 C-peptide 的程度，很大一部分反映了移植前分化品質，而不單純由 immune rejection 狀態決定。

這個觀察對後續詮釋非常重要：即便 allogeneic grafts 有明顯免疫浸潤，C-peptide 仍可能維持或上升，原因可能包括分化效率較佳、殘存 β-like cells 持續功能、或 graft injury 後的 endocrine proliferation / regenerative response。

Image Mass Cytometry：allogeneic grafts 具有更強的人類免疫浸潤

實驗末端，研究團隊使用 image mass cytometry（IMC） 對 iPSC-derived islet grafts 進行組織層級分析。結果符合預期：allogeneic grafts 的 immune infiltration 顯著高於 autologous grafts。

分析不只計算 CD45+ immune cells 的總比例，也評估 immune cell clustering。具體而言，研究團隊量測在 islet 與 fibrotic regions 中：

human CD45+ cells 所占比例；
以 100 μm 半徑內 human CD45+ cells 的最大數量，作為 CD45+ cell clustering / local immune aggregation 的指標。

Allogeneic grafts 不僅有較高比例的 CD45+ immune cells，也呈現更明顯的 CD45+ cell clustering，代表 immune cells 在 graft 內或 graft 周邊局部聚集，符合正在發生或持續中的 allogeneic immune response。

IMC 影像以 C-peptide、glucagon、pan-keratin 標示 graft / endocrine epithelial components，並以 CD45 標示人類免疫浸潤、collagen 標示纖維化區域；定量則聚焦在「islet and fibrotic regions」中的 human CD45+ cells。

這些結果顯示，此 human immune system mouse model 能夠在體內重現人類免疫系統對 allogeneic iPSC-derived islet grafts 的強烈反應，並且 autologous grafts 相對較少被人類免疫細胞浸潤。

免疫浸潤組成：CD68+CD163+ macrophages 與 CD8+ T cells 在 allogeneic grafts 中富集

接著，研究團隊進一步分析 graft 內 immune infiltrates 的組成。整體來說，autologous 與 allogeneic grafts 的 immune cell composition 大致相似，但有兩個族群在 allogeneic grafts 中顯著增加：

CD68+CD163+ macrophages；
CD8+ T cells。

CD68+CD163+ macrophages 通常與 anti-inflammatory responses、tissue remodeling 相關，也曾被證實參與 allogeneic fibrosis 的形成。這提示 allogeneic grafts 中的 macrophage response 不只是單純發炎殺傷，也可能伴隨 tissue remodeling 與 fibrosis。

另一方面，CD8+ T cells 是 allogeneic rejection 的主要效應細胞之一。它們在 allogeneic grafts 中富集，支持該模型確實捕捉到 alloimmune-mediated graft injury 的關鍵特徵。

免疫組成分析涵蓋多個 human immune subsets，包括 CD3−CD56+ cells、CD3+CD8+ T cells、CD3+CD4+ T cells、CD20+ B cells、CD68+CD163+ macrophages、CD68+CD163− macrophages，以及 CD14/CD16 定義的 monocyte subsets；代表性影像同時標示 C-peptide、glucagon、collagen，並搭配 CD68/CD163 或 CD8/CD4 來定位 macrophage 與 T-cell infiltrates。

這些資料說明 allogeneic graft rejection 並非單一細胞類型造成，而是多種 human immune cell populations 共同參與；但在本模型中，最能區分 allogeneic 與 autologous grafts 的族群是 CD8+ T cells 與 CD68+CD163+ macrophages。

胰島內分泌細胞組成：glucagon+ cells 最多，C-peptide+NKX6.1+ cells 反映分化效率

在 autologous 與 allogeneic grafts 中，都可偵測到多種 endocrine cell types，包括：

C-peptide-positive cells；
glucagon-positive cells；
somatostatin-positive cells；
ghrelin-positive cells。

其中，glucagon-positive cells 是最豐富的 endocrine population。這表示 iPSC-derived islet grafts 內不只含 β-like cells，也包含其他 endocrine lineages，且 α-like glucagon+ cells 在這些 grafts 中占比較高。

C-peptide-positive cells 的比例與先前血中 C-peptide 結果一致：autologous cohort 1 的 grafts 中 C-peptide-positive cells 比例較高。此外，C-peptide 與 NKX6.1 雙陽性細胞的比例也反映移植前 iPSC-to-β cell differentiation 的效率：

autologous cohort 1 最高；
cohort 2 最低。

這再次支持一個重要結論：移植後 graft endocrine output 與細胞組成，很大程度受到移植前分化品質影響。因此，在評估免疫攻擊對 graft function 的影響時，必須同時考慮每一批 iPSC-derived islet differentiation 的成熟度與 β-like cell yield。

Allogeneic grafts 中 immune cells 與 endocrine cells 皆呈現較高 proliferation

研究團隊進一步分析 proliferation marker Ki-67。結果顯示，allogeneic grafts 的增殖活性高於 autologous grafts。

首先，在 allogeneic grafts 中，CD45+Ki-67+ immune cells 顯著增加，這很可能代表 graft 內存在 active ongoing immune attack，免疫細胞正在局部擴增或活化。進一步看 T cells，proliferating T cells 的比例也在 allogeneic grafts 中較高，符合 allogeneic immune response 持續進行的解釋。

更令人意外的是，allogeneic grafts 中的 α cells 與 β cells 也比 autologous grafts 更具 proliferative phenotype。也就是說，不只是 immune cells 在增殖，endocrine cells 本身也出現較高 Ki-67 positivity。

這個現象可能代表 iPSC-derived islet grafts 在免疫破壞後啟動某種 regenerative / compensatory response。這也可能解釋為何即使 allogeneic grafts 正在遭受免疫攻擊，circulating C-peptide levels 仍然能在研究期間維持較高或持續上升：殘存 β-like cells 或 endocrine progeny 可能在 injury 後增殖，部分補償免疫介導的損傷。

proliferation 分析特別定量了 glucagon+ cells 中 Ki-67+ 的比例，以及 C-peptide+ cells 中 Ki-67+ 的比例；代表性影像以 C-peptide、glucagon、CD45、Ki-67 同時呈現 endocrine compartments 與 immune-cell proliferation。

這個結果讓模型不只是 rejection model，也提供一個觀察「免疫傷害後 endocrine graft repair / regeneration」的體內平台。

建立 T1D-like autoimmunity 模型：導入 islet antigen-reactive TCR-positive T cells

為了模擬 T1D 中針對胰島抗原的 autoimmune response，研究團隊從 human immune system mice 的脾臟分離 T cells，並將這些 T cells transduce 成表現 islet antigen-reactive TCRs 的 T cells。這些 TCR clones 先前是在 T1D 病人的 islets 或 blood 中被鑑定出來，代表它們具有與 T1D 相關的 islet antigen specificity。

在製備這些 T cells 時，團隊同時使用 CRISPR-Cas9 technology 移除 endogenous TCR chains，以最大化 transgenic TCR 的表現，避免內源性 TCR 與導入的 TCR 競爭或形成錯配。經過 expansion 後，這些 islet-reactive TCR-positive T cells 被 adoptively transferred 到已經植入 autologous iPSC-derived islet grafts 的小鼠體內。

每隻 recipient mouse 每個 clone 接受約 0.1 到 0.5 million TCR-positive T cells。Adoptive transfer 後三週犧牲小鼠並分析 grafts。

結果顯示，接受 islet antigen-reactive TCR-positive T cells 的 autologous grafts，與未接受 T-cell transfer 的 autologous grafts 看起來相似。無論是 CD3+ T-cell infiltration，或更廣泛的 CD45+ immune-cell infiltration，都沒有顯著增加。

不過，這並不代表導入的 T cells 沒有存活。至少 clone 5 的 T cells 可透過 GFP reporter 與其特異性 Vβ 偵測到，且在所有接受轉基因 T cells 的小鼠脾臟中都能找到。也就是說，這些 autoreactive / islet-reactive TCR-positive T cells 可以在體內 persistence，但它們並未有效進入 autologous islet grafts。

這個結果非常關鍵：單純提供 islet antigen-reactive T cells，並不足以觸發自體 iPSC-derived islet grafts 的 autoimmune infiltration。自體免疫攻擊可能還需要額外條件，例如 antigen presentation 強化、inflammatory priming、局部 tissue injury、costimulation、innate inflammation，或 T cells 本身需要更適當的 activation state。

整體結論：平台可研究 human islet immunity，但自體免疫觸發需要額外訊號

本研究建立了一個 humanized mouse model，可用於在體內研究人類免疫系統對 human iPSC-derived islet grafts 的反應。主要結論包括：

Allogeneic iPSC-derived islet grafts 會誘發強烈 human immune response；
Allogeneic grafts 中可見多種 immune cell populations 浸潤，特別是 CD8+ T cells 與 macrophages；
Allogeneic grafts 也呈現 endocrine cell proliferation，可能反映免疫傷害後的補償或再生反應；
Islet antigen-reactive TCR-positive T cells 能在體內存活，但未能自發浸潤 autologous grafts；
因此，T1D-like autoimmune graft infiltration 可能需要額外 triggering factors。

這個 human immune system mouse model 可作為獨特平台，用來研究 human islet immunity，並測試 T1D β-cell replacement therapy 的新策略，包括如何避免 allogeneic rejection、如何理解 autologous graft 的 autoimmune risk，以及如何調控 graft injury 後的 regeneration。

致謝中包括共同完成此工作的 Camillo Bechi Genzano，以及指導者 Megan Sykes 與 Remi Creusot；相關團隊與合作者包括 Sykes lab and Creusot lab（CCTI）、Xiaolan Ding、Rebuma Firdessa Fite、Yiming Luo，Egli lab 的 Qian Du 與 Sakshi Bhatele，Kaestner lab 的 Daniel Traum 與 Deeksha Lahori，Millman lab 的 Matthew Ishahak 與 Enrique Eduardo Sanchez-Castro，以及 Berkland lab 的 Grant Downes 與 Kyle Apley。資助與支持來源包括 Breakthrough T1D（formerly JDRF）、Human Islet Research Network（HIRN）、NIH 與 American Diabetes Association。

討論與問答

Allogeneic islets 的 HLA mismatch 是否涵蓋 class I 與 class II？

第一個問題聚焦在 non-autologous / allogeneic iPSC-derived islets 與 human immune system donor 之間的 HLA mismatch：是否同時在 HLA class I 與 class II loci 不相合？

回答是：這些 allogeneic islets 來自完全無關 donor，因此在 HLA class I 與 class II 都是完全 mismatched。這點支持 allogeneic grafts 中觀察到的強烈 immune infiltration 與 CD8+ T-cell enrichment，確實可能是高度 HLA mismatch 下的 allogeneic immune response。

Graft 中是否有 human endothelial cells？會不會影響 T-cell infiltration？

另一個問題詢問 iPSC-derived islet grafts 中的 endothelial cells 是否也是 human origin。提問者指出，如果 graft 內含 human endothelial cells，而 host 是 mouse T cells，可能會因 adhesion receptor incompatibility 導致 mouse T cells 難以穿越 human endothelium。但在本研究中，immune effector cells 是 human T cells，而且是在 humanized mice 內發育而來，因此理論上比較接近 human-on-human immune interaction。

對於 graft 內是否含有 human endothelial cells，回答較保守：目前不確定這些 grafts 是否包含 human endothelial cells；研究者傾向認為可能沒有，但需要進一步確認。

這個問題點出未來模型優化的一個重要面向：graft vascularization 與 endothelial origin 可能影響 immune trafficking、T-cell entry、adhesion molecule interaction 與局部 inflammation。

為何 autoreactive TCR-positive T cells 沒有進入自體 graft？是否需要額外 injury 或 inflammatory trigger？

最後一個問題聚焦在最有趣的結果之一：islet antigen-reactive TCR-positive T cells 沒有 home 到自體 graft。這可能表示 graft 或局部環境存在某種保護層，也可能表示 autoimmune infiltration 需要額外 injury signal。

研究者回應，先前類似模型中，若要讓 autoreactive T cells 活化，可能需要進行 immunization，例如給予相對應 peptide antigen。未來可考慮在 inflammatory conditions 下給予 antigenic peptide，以促進 autoreactive T cells activation，進而測試它們是否會進入 graft。

此外，研究團隊也分析了這些 T cells expansion 後的 phenotype，發現它們多數呈現 effector memory phenotype。這可能代表經過體外 expansion 後，T cells 有某種功能疲乏或狀態不佳，影響其 homing 或 graft infiltration 能力。

研究者也檢查了 grafts 的 HLA expression，發現 allogeneic grafts、autologous grafts，以及接受 transgenic T cells 的 autologous grafts 之間沒有明顯差異。因此，autoreactive T cells 未浸潤 graft 並不是因為 graft 缺乏 HLA expression。下一步可能是在 adoptive transfer 後對小鼠進行 immunization，以提供更強的 antigen-specific activation 與 inflammatory context。

Take-home Summary

T1D β-cell replacement therapy 需要解決兩個免疫問題：allogeneic rejection 與 autoimmune recurrence。
本研究建立 human immune system mice，並結合 autologous 與 allogeneic human iPSC-derived islet grafts，提供體內研究 human islet immunity 的平台。
Allogeneic grafts 明顯誘發 human immune infiltration，且 CD45+ cells 不只增加，也更集中成 cluster。
Allogeneic grafts 中 CD8+ T cells 與 CD68+CD163+ macrophages 特別富集，符合 allogeneic rejection 與 tissue remodeling / fibrosis 的免疫特徵。
iPSC-derived grafts 內含多種 endocrine cells，glucagon+ cells 最多；C-peptide+NKX6.1+ β-like cell proportion 反映移植前分化效率。
Allogeneic grafts 中 immune cells 與 endocrine cells 都更具 Ki-67 positivity，提示 ongoing immune attack 之外，也可能存在 injury-induced endocrine proliferation。
導入 T1D 相關 islet antigen-reactive TCR-positive T cells 後，這些細胞可在體內存活，但不會自發浸潤 autologous grafts。
自體免疫性 graft attack 可能需要額外 antigenic stimulation、inflammation、injury signal 或更合適的 T-cell activation state。
此模型可用於未來測試 β-cell replacement therapy 的免疫保護策略、抗排斥策略，以及促進 graft survival / regeneration 的新治療。