這是一份詳細的、二合一的演講逐字稿重建筆記。內容以講者的口述為主軸，並將投影片（Slides）中的數據、圖表細節、實驗文獻與流程，以無縫融合的方式補充於對應的段落中。
為清楚區分來源，粗體用於強調核心概念與講者的重要論點，而底線則專門標示出「講者未口述，但直接提取自投影片」的補充資訊、具體數據或文獻出處。
幹細胞衍生 β 細胞於細胞治療之應用：進展、障礙與未來方向
(Stem Cell Derived Beta Cells for Cell Therapy: Progress, Hurdles and Future Directions)
本次演講由佛羅里達大學 (University of Florida) 糖尿病研究所暨藥理與治療學系的副教授 Holger A. Russ 於 2026 年 3 月 13 日的 ATTD 2026 會議中發表。講者披露的利益衝突包含：Tolerance Bio 科學共同創辦人暨顧問、Sernova 臨床諮詢委員會成員，以及 Guidepoint 與 Axxon Advisors 顧問。
直接分化的進展與回顧
讓我們直接進入主題。首先回顧幹細胞衍生 β 細胞的直接分化 (Directed Differentiation)。我們必須記住，直接分化的過程其實就是在體外模仿器官的發育階段。整個標準流程大約需要 23 天：從 3D 培養的人類多能幹細胞 (hPSC, 第 0-3 天) 開始，依序發育成定型內胚層 (Definitive Endoderm, 第 4-5 天)、原始腸管 (Primitive Gut Tube, 第 6-9 天)、胰臟前驅細胞 (Pancreatic Progenitor, 第 9-15 天)，進入內分泌階段 (Endocrine, 第 16-23 天)，最終形成幹細胞衍生 β 細胞 (sBC)。
當分化成功時，我們能在顯微鏡下看到類似原代胰島的球狀聚集結構。**免疫螢光染色證實了這些結構中含有生長抑素 (SST, 藍色)、胰島素 (INS, 綠色) 與升糖素 (GCG, 紅色)。**我們可以透過修飾幹細胞使其表現 GFP（綠色螢光蛋白），藉此即時監測活體細胞的胰島素表現。這項技術的奠基來自於許多實驗室的貢獻與團隊合作，包含了 Viacyte 公司、許多發育生物學家，以及 Melton 和 Kieffer 實驗室的基礎論文。我們實驗室也有幸能在早期為這項技術做出貢獻，首度展示了在培養皿中生成具功能性胰島素分泌細胞的可能性。自 2006 年 D'Amour 等人的《自然生物技術》論文起，到 Russ 實驗室在 2011 至 2025 年間於《Cell Stem Cell》、《Cell Metabolism》等期刊發表的數十篇研究，證明了這是一個持續進展的領域。
量產擴增的挑戰與臨床前景
一開始，這項技術看起來或許很簡單。我們最初只是用懸浮培養皿把細胞放進培養箱，那真的是一種「土法煉鋼」(MacGyver-ed) 的做法。這種懸浮培養皿主要用於早期觀察和監測細胞團塊。後來我們逐漸進階到攪拌式培養 (stirrer cultures) 進行中等規模的細胞培養，到現在，我們的實驗室甚至能使用最高容量達 500 毫升的 PBSmini 生物反應器來進行大規模生產。
然而，每一次的規模升級本身就是一項巨大的挑戰。舉例來說，你必須考慮到在這麼大體積中的氧氣供應問題。因此，對於任何想要將此技術擴大化並具備成本效益的人來說，量產擴增絕對是一道難關。不過，我們對這項技術治癒疾病的前景都感到無比興奮。這些細胞現在已經進入臨床試驗並實際幫助病患，甚至已經有第三期臨床試驗正在招募受試者。當我還在攻讀博士學位、剛開始這段研究旅程時，我一度以為這只是科幻小說，但現在它確實正在發生。2025 年 9 月《新英格蘭醫學雜誌》(NEJM) 更正式發表了一篇關於「幹細胞衍生完全分化胰島用於第 1 型糖尿病」的臨床試驗報告。
優化生產與冷凍保存技術
既然我們已經取得了一些成就，那過程中還有什麼是我們應該改進的？整個分化是一段非常複雜的過程。在早期的階段，每個步驟通常只需要兩到三天，但當我們從胰臟前驅細胞進入內分泌分化階段時，我們其實還無法很好地掌握與控制，這一步驟耗費的時間要長得多。有些方案甚至需要花費好幾週來完成分化。當你要將這套流程導入 GMP 規格時，只要能減少幾天的製程（更別說是幾週），就能在製造成本上帶來巨大的改變。
另外，當我們有能力在三公升的反應器中培養出海量的細胞時，我們該如何處理這些細胞？我們需要**「暫停點」(stopping points)**。我們已經發表過相關研究，現在我們可以在生產過程的特定階段，將這些胰島素分泌細胞冷凍保存下來。我們最喜歡的結果是，當我們將這些細胞解凍時，它們的功能實際上得到了改善，而且不需要的雜細胞也被清除了。這賦予了我們極大的實驗與生產彈性。
尋找最佳的 β 細胞表型與對抗缺血損傷
接下來我們面臨的核心問題是：無論是用於體外疾病模型還是實際移植，最理想的 β 細胞表型究竟是什麼？我們是否只需要一個「運作尚可」的細胞，還是一個「高度分化」的極致細胞？
通常我們可能會認為，β 細胞分化得越成熟，對壓力的敏感度就越高。作為對照組的人類胰島，當我們讓它暴露在不該有反應的丙酮酸 (pyruvate) 中時，它確實沒有反應；在低血糖與高血糖測試中，它展現了標準的第一相 (first phase) 與第二相分泌，並能在 KCl 測試中順利去極化。 而我們培養出的第一代幹細胞衍生細胞 (Gen 1 sBC) 看起來有些不成熟，它們缺乏第一相分泌，但可以被去極化。到了第二代細胞 (Gen 2 sBC)，它們看起來好多了，出現了第一相分泌，雖然第二相仍有待商榷，但對 KCl 去極化的反應幅度與原代胰島非常相似。**在六週時的數據顯示，Gen 2 sBC 的 C-peptide 含量顯著高於 Gen 1 sBC。**有趣的是，當我們將那些「在培養皿中功能不完美的細胞」移植到臨床前的 NOD 小鼠體內時，它們在動物體內卻能正常運作。這呼應了移植外科醫師告訴我的話：在實際移植進去並看到結果之前，你永遠無法確切知道胰島移植物的表現會如何。
這引導出我們移植時遭遇的另一個巨大挑戰：缺血誘導的移植物死亡 (Ischemia-induced sBC loss) 以及移植部位的選擇。我們嘗試了不同的移植部位。**根據我們發表在《Stem Cell Reports》上的資料，**當我們將帶有螢光素酶 (luciferase) 的細胞移植到小鼠的腎包膜 (Kidney Capsule, KC) 或皮下 (Subcutaneous, SQ) 時，**生物發光影像 (BLI) 顯示從第 0 天到第 7 天，**我們大約失去了一半的移植物。當我們使用能標記胰島素分泌細胞的 GFP 報告基因時，我們發現在高度分化的細胞狀態下，這種細胞流失的情況甚至更加劇烈，**GFP 陽性細胞比例在移植後第 7 天呈現極顯著的下降。**因此，這部分還有許多工作有待完成。
異體排斥與自體免疫復發的挑戰
除了缺血，我們還必須妥善管理同種異體排斥 (allogenic rejection)，這可以透過聯合免疫療法或進階修飾細胞來實現。但更棘手的是自體免疫的復發 (recurrence of autoreactivity)。文獻指出，即使你進行了整個器官的移植，並且成功控制了全身性的同種異體排斥反應，自體免疫機制仍會捲土重來，並精準地摧毀那些會分泌胰島素的細胞。最近由 Pugliese 等人發表的研究也再次更新並確認了胰臟移植患者自體免疫復發的困境。
我們目前的處境是：在努力為病患開發新型治療模式的同時，我們依然不完全明白為什麼自體免疫糖尿病會在人體內發生。對我來說，你必須了解問題的本質，才能真正解決它。我最終的目標是，希望能為「將第 1 型糖尿病 (Type 1) 轉變為零型糖尿病 (Type none)」貢獻一己之力。
CD155 / TIGIT 免疫檢查點的保護潛力
俗話說條條大路通羅馬，我們先前已經聽過了利用 CD45 進行細胞保護的精彩研究。那麼，是否還有其他途徑可以保護 sBC 免受自體免疫復發的攻擊？我們是否能建立一個精準的、符合人類 HLA 配對的體外檢測法來模擬這種免疫與 β 細胞的交互作用？
我們的實驗室專注於 CD155 與 TIGIT 免疫檢查點。簡單來說，當 T 細胞或 NK 細胞被活化時，它們表面會上調表現 TIGIT。TIGIT 對 CD155 具有高親和力，當兩者結合時，會產生「抑制」信號，阻止免疫細胞攻擊。然而，T 細胞上還有另一個受體叫做 CD226（這是一個帶有第 1 型糖尿病風險單核苷酸多型性 SNP 的基因位點）。當 CD226 與 CD155 結合時，卻會導致 T 細胞的「刺激」與活化。這就像太極的陰與陽一樣，是一種競爭結合的機制。因此，抑制 CD226 或是增強 TIGIT 結合，在預防自體免疫上展現了極大的潛力。
我們從黑色素瘤 (melanoma) 等癌症如何逃避免疫監視的研究中學到了很多。**近期有一種高親和力的 CD155 突變體 (rs1058402; G>A; Ala67Thr) 被發現，它通常與癌症患者的預後不良有關。**所以我們思考：我們是否能利用這個高親和力的 CD155 突變體，強制將信號導向 TIGIT，藉此恢復或賦予幹細胞衍生 β 細胞免疫耐受性？
基因工程修飾與受體親和力驗證
為了驗證這點，我們使用了 TALEN 基因編輯技術，**將野生型 (WT) 或 Ala67Thr 突變型 (Mut) 的 CD155 構建體精準插入 Mel1 hPSC 的 AAVS1 基因座。**我們建立了三個實驗組：對照組 Mel1、野生型 CD155 (WT)、以及突變型 CD155 (Mut)。 修飾完成後，**流式細胞儀顯示 CD155 的過度表現率高達 99.6%。**接著，我們使用螢光標記的 TIGIT 進行結合曲線測試，結果如我們預期，WT 和 Mut 組都顯示出結合力的增加；而 CD155 突變體 (Mut) 展現了最高的 TIGIT 結合親和力，與對照組相比達到了極顯著的統計差異 (p=0.0001)。
接下來，我們帶著這些基因修飾過的幹細胞進行 23 天的分化流程，並同樣使用 GFP 報告基因。這套流程運作得非常好，**從第 0 天、第 3 天、第 9 天一直到第 23 天的顯微影像顯示，細胞順利長成團塊，**且最終大約產生了 50% 我們所需要的胰島素分泌細胞。它們具備正常功能，對高葡萄糖有反應，我們也能觸發放大路徑。更重要的是，**免疫螢光染色與流式數據證實，**這些細胞在分化為 sBC 後，依然完美保留了 CD155 的表現。
我們同時在 sBC 的狀態下再次測試了與 TIGIT 的結合力，這個特性依然成立——突變體擁有最高的親和力。當我們將其與刺激分子 CD226 的結合力進行對比時，可以看到曲線產生了左移現象，這意味著在我們的系統中，TIGIT 具有比 CD226 更高的結合親和力。因此我們預期，這種設計能成功將免疫信號導向「抑制」。
體外細胞毒性與免疫抑制實驗結果
那這在功能性上該如何證明呢？我們將這三種擁有 HLA-A2 共通等位基因的細胞株打散成單細胞，並用干擾素 γ (IFN-γ) 處理，以確保它們上調表現 HLA 第一型抗原，這樣 T 細胞才能夠辨識它們。實驗結果顯示，三組細胞的 HLA 都出現了極顯著的上調，但非常重要的一點是，CD155 的表現量並未受到 IFN-γ 處理的改變，這確保了我們的實驗模型仍能維持原本的設計初衷。
至於 T 細胞的來源，我們從白血球分離層 (leukapaks) 中分離出初始 (naive) CD8+ T 細胞，然後透過慢病毒轉染導入名為 1E6 的 T 細胞受體 (TCR)。這個 1E6 Avatars 專門針對受 HLA-A2 限制的前胰島素原胜肽 15-24 (pre-proinsulin peptide 15-24)。雖然我們現在有更多針對其他疾病刻板抗原的 TCR avatars，但在這項研究中我們使用的是這個。
我們將標記了放射性鉻 (Chromium) 的 β 細胞與這些 T 細胞混合作用，**設定了效應細胞與目標細胞的比例 (E:T Ratio) 為 1:1、5:1 與 10:1。**結果發現，T 細胞 avatars 的活化標記物出現了顯著的下調（雖然圖形呈現雙峰分佈，我們還不完全理解原因，但結果依然是顯著的）。
直接跳到細胞毒性 (Cytotoxicity) 檢測的部分：在這個直接的自體反應檢測中，我們發現隨著效應細胞對目標細胞比例的增加，**CD155 突變體組 (Mut) 對細胞毒性的抑制達到了極高的顯著性，特異性裂解 (Specific Lysis) 降到最低。**同時，這也伴隨著多種效應分子的顯著減少，包含 Fas 配體 (FasL)、顆粒酶 B (Granzyme B)、穿孔素 (Perforin) 以及顆粒溶素 (Granulysin)，特別是在 10:1 的比例下，CD155 突變體的抑制效果最為顯著。
這些數據強烈表明，CD155 確實能夠有效抑制 T 細胞的活化與殺傷力。為了解這是否確實是透過 TIGIT 途徑發生的，我們設計了進一步的實驗，使用野生型或突變型細胞，並在 avatars 細胞上預先使用同型對照抗體或抗 TIGIT (anti-TIGIT) 阻斷抗體進行處理...（演講錄音於此處結束）。