ESR1 突變背景下的 PR 介導抗藥機制（Mechanisms of PR-Mediated Resistance: The Role of ESR1 Mutants）

會議／場次： ENDO 2026／SY04 — The PR Puzzle: Context-Dependent Actions Reveal Therapeutic Potential
短講： SY04-03
講者： Thu H. Truong, PhD（Assistant Professor, Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, Masonic Cancer Center, University of Minnesota）

整理稿

研究背景：雌激素受體陽性乳癌的復發特性與抗藥機制

乳癌患者的術後復發型態因腫瘤亞型而異。在雌激素受體陽性（estrogen receptor-positive, ER-positive）乳癌中，患者趨向於發生晚期復發（late relapse），即復發常發生在初次診斷並接受治療 5 年之後；且此種復發風險可持續維持高檔長達 20 年，形成患者的終生風險（lifetime risk）。

臨床上，ER 陽性腫瘤主要接受內分泌治療（endocrine therapies），初期治療反應良好，但高達 40% 的患者最終會產生獲得性抗藥性（acquired resistance），並進一步進展至遠端轉移（metastasis）。

造成內分泌抗藥性的因素相當複雜，講者實驗室長期專注於癌症幹細胞（cancer stem-like cells, CSCs）的研究：

幹細胞特性：CSCs 增殖能力較低（poorly proliferative），以細胞次族群的形式隱匿於復發性乳癌腫瘤中。
逃脫機制：CSCs 在治療打擊後存活的能力，使其得以逃脫針對快速分裂腫瘤細胞的標準內分泌及化學療法。
其他關鍵機制：包括與生長因子等信號通路的交叉對話（crosstalk），以及對 ER 與黃體素受體（progesterone receptor, PR）等類固醇受體的調控修飾。

演講預告補充：同屬講者團隊的 Julie H. Ostrander 博士將於週一發表關於類固醇受體共調節因子（steroid receptor coregulators）的合作研究，而 Anna Kopin 博士亦將於週一同一場次深入探討 PR 的調控細節。

PR 與 ER 的交互作用及 PR 磷酸化修飾（Ser294）

在乳癌腫瘤生物學中，類固醇受體之間的交叉對話扮演重要角色：

傳統觀點：PR 一直被視為 ER 的下游標的基因（ER target gene），且臨床上長期將總 PR 濃度（total PR levels）作為功能性 ER 的生物標記。
結合與調控功能：近年多項研究證實，PR 本身即為 ER 的直接結合夥伴（binding partner），並能直接調控修飾 ER 的轉錄活性。
激酶磷酸化：PR 可被多種在乳癌中常出現調控失常的蛋白激酶（protein kinases）磷酸化。Carol A. Lange 博士團隊深入剖析了 PR 磷酸化的角色，特別是在 Ser294 位點（Ser294 site） 的磷酸化，證實其會直接促進 CSC 族群的擴增。

這些磷酸化事件使 PR 能夠促進內分泌抗藥性，凸顯了 PR 作為疾病進展驅動者（driver of disease progression）的新興角色。儘管臨床上利用 PR 標的策略的手段仍相當有限，但目前已有許多臨床試驗正積極評估其可行性。

ESR1 突變（Y537S 與 D538G）與 PR 的表現特徵

內分泌治療後引發抗藥性的另一個重要機制，是 ER 基因（ESR1）配體結合域（ligand-binding domain）發生的獲得性功能（gain-of-function）突變，最常見的突變型別為 Y537S 與 D538G 突變：

分子效應：這些突變將 ER 穩定在活化構象（active conformation），形成不依賴雌激素的持續活化 ER（constitutively active estrogen-independent ER），進而降低腫瘤對內分泌治療的敏感性。講者並提到，針對 ESR1 突變型乳癌已有新藥獲批。
影像學發現：Amy Fowler 博士團隊利用 PET 影像學研究顯示，在 ESR1 突變型腫瘤中可觀察到 PR 表現量顯著增加，此特徵或許可作為識別對內分泌治療療效下降的影像生物標記。

研究問題提出：傳統邏輯下，PR 是由雌激素驅動的 ER 標的基因；當受到黃體素（progestin）或生長因子刺激時，PR 會發生轉譯後修飾（post-translational modifications），其磷酸化事件最終改變 PR 對乳癌細胞增殖與轉移的影響。講者團隊在實驗中觀察到 ER-PR 複合物中包含已磷酸化的 PR 物種（phosphorylated PR species），因而提出核心問題：

在 ESR1 突變的情境下，PR 的表現與活性發生了何種變化？
PR 是否為驅動 ESR1 突變體中 CSC 擴增表型的關鍵？
PR 的 Ser294 等位點磷酸化在此過程中扮演了何種角色？

Patient-Derived Xenograft (PDX) 模型與細胞株中的 PR 表現與結合驗證

為了驗證 ESR1 突變腫瘤中的 PR 狀態，講者團隊與 Colorado 大學 Carol Sartorius 博士團隊合作（由 Amy Dwyer 博士領導研究），利用 ER 陽性 PDX 模型（UCD65 與 UCD4）進行原發腫瘤與轉移灶的免疫組織化學染色：

UCD65 模型：包含 ESR1 基因放大（amplified ER gene）。
UCD4 模型：包含 ESR1 D538G 突變。

PDX 腫瘤檢測結果：研究團隊使用臨床總 PR 抗體以及 Carol Lange 團隊自製的磷酸化 PR 抗體進行檢測，結果顯示：

原發 PDX 腫瘤中含有非常豐富的磷酸化 PR。
在 PDX 小鼠的腦轉移灶（brain metastases）中，磷酸化 PR 同樣呈現顯著富集（enriched）。

基因編輯細胞株模型設計：為了深入進行機制探討，講者團隊採用由 David J. Shapiro 博士與 Ben Ho Park 博士團隊利用基因編輯技術建立的 T47D 與 MCF7 背景細胞株，分別表現野生型 ER（wild-type ER）或突變型 ER（Y537S 或 D538G）：

Western Blot 分析：在無雌激素（estrogen）的基線條件下，兩種 ESR1 突變模型（Y537S 與 D538G）的總 PR 基線表現量均顯著升高。給予合成黃體素 R5020 處理後，突變株展現出強烈的黃體素反應性（透過 phospho-PR 抗體檢測）。野生型模型則必須在給予雌激素誘導後，其 PR 表現量才能達到與 ESR1 突變株相當的水平。
MAPK 磷酸化位點：PR 在 Ser294 與 Ser345 兩個 MAPK 磷酸化位點的變化趨勢與總 PR 完全一致。
Co-IP 蛋白質交互作用檢測：共免疫沉澱（co-immunoprecipitation, co-IP）實驗顯示，在未添加外源激素的條件下，野生型模型（T47D 與 MCF7）中可檢測到固有的 ER-PR 交互作用；但在兩種 ESR1 突變模型中，該交互作用在無激素狀態下均大幅減少（greatly reduced）。
PLA 近接結合標定分析：由研究生 Sai Harshita Posani 完成的近接結合標定分析（proximity ligation assays, PLA；藍色為 DAPI 標定核，紅色螢光點代表 ER-PR 結合）驗證了 co-IP 的發現：
- 野生型模型：給予雌激素或 R5020 處理均能顯著增加 ER-PR 交互作用。
- Y537S 突變模型：單獨給予雌激素無法增加 ER-PR 結合，僅有在給予 R5020 處理時才會誘導 ER-PR 交互作用增加。
- 這顯示在 Y537S 背景下，突變 ER 本身雖具雌激素非依賴性，但 ER-PR 複合體形成仍可被 progestin R5020 誘導，而 E2 並未增加此交互作用；不能把兩者簡化為完全不受配體影響。

癌症幹細胞（CSC）擴增與功能性檢測

鑑於實驗室對 CSCs 的關注，講者團隊進一步評估了 ESR1 突變對 CSC 表型的影響：

1. CD44-high/CD24-low 次族群分析

利用流式細胞儀測量乳癌 CSCs 的經典表面標記 CD44-high/CD24-low 比例：

2D 貼壁培養：Y537S 突變株展現出最高程度的 CD44-high/CD24-low 族群增加。
3D 腫瘤球培養：在無血清、超低貼壁盤及腫瘤球培養基（tumorsphere medium）條件下，Y537S 突變帶來的 CD44-high/CD24-low 族群擴增效果被進一步放大。
D538G 突變：在 3D 培養條件下，D538G 突變株的 CD44-high/CD24-low 族群亦顯著高於野生型，但增加幅度低於 Y537S 突變株，且此現象僅在 3D 條件而非 2D 條件下觀察到。

2. 腫瘤球形成實驗（Tumorsphere Assays）與激素依賴性

在體外 CSC 自我更新（self-renewal）實驗中，Y537S 突變株在 T47D 與 MCF7 模型中均展現出顯著增強的腫瘤球形成能力。

激素成分解析：由於標準腫瘤球培養基的專利成分含有背景激素，團隊先以活性碳脫脂（charcoal stripping）去除背景激素，再分別補回 E2 與 R5020。在講者展示的這組去除後補回實驗中，R5020 是出現腫瘤球形成反應的關鍵處置；這是特定細胞與培養條件下的結果。

3. 藥物處置與 shRNA 敲降對比

內分泌藥物：使用傳統內分泌藥物 tamoxifen 以及新一代內分泌療法 elacestrant 與 lasofoxifene 處置，均能顯著抑制野生型與突變型模型的腫瘤球形成能力。
抗黃體素藥物（Antiprogestins）：使用抗黃體素藥物 onapristone、mifepristone (RU486) 及 PRA-027 處置時，在 T47D 模型中未觀察到可測量的抑制效果，在 MCF7 模型中僅觀察到微弱（modest）的抑制效果。
shRNA 敲降 PR：由於抗黃體素藥物處置效果有限，團隊轉而採用 shRNA 基因敲降技術抑制 PR 表現（shPR），並將焦點集中於幹細胞表型最顯著的 Y537S 突變：
- Western blot 證實成功敲降 PR 表現。
- 腫瘤球實驗顯示：敲降 PR 後，野生型模型的腫瘤球形成減少約 50%；而在 Y537S 突變模型中，敲降 PR 使腫瘤球形成顯著降低了約 75%（與各自 shGFP 對照組相比）。

體內（In Vivo）乳腺導管內注射模型與循環腫瘤細胞（CTC）轉移潛力

為了評估 PR 在體內的生理功能，講者團隊與 Minnesota 大學 Julie Ostrander 博士合作，採用由 Cathrin Brisken 博士團隊開創的乳腺導管內（mammary intraductal, MIND）小鼠模型：

實驗設計：將 T47D 野生型與 Y537S 突變株（具備 shGFP 對照或 shPR 敲降）直接注射入小鼠乳腺導管結構中，追蹤觀察 8 週。
原發腫瘤負擔（Primary Tumor Burden）：透過 H&E 組織切片量化腫瘤面積。注射 Y537S 突變株的小鼠，其原發腫瘤負擔顯著高於野生型小鼠。然而，敲降 PR 對原發腫瘤負擔的影響呈現分化：在野生型模型中敲降 PR 反而導致腫瘤負擔增加，但在 Y537S 突變模型中敲降 PR 則未產生可測量或顯著的改變。
循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）轉移潛力：在採集導管腫瘤的同時採集小鼠血液，分離 CTCs 並進行軟洋菜膠殖落形成實驗（soft agar assays），測量具備致腫瘤與幹細胞特性的細胞存活能力：
- 注射 Y537S 突變株的小鼠，其血液中分離出的 CTC 殖落形成數量顯著高於野生型。
- 敲降 PR 能顯著削弱（attenuate）由 Y537S 突變所引發的 CTC 殖落形成能力，證實 PR 在突變體介導的腫瘤細胞遠端播散與轉移潛力中扮演關鍵角色。

轉錄組（RNA-seq）與 Genomic Binding（ChIP-seq）分析

1. 2D 轉錄組分析

在 2D 培養條件下，給予雌激素、R5020 或二者聯合處置並進行 RNA-seq：

野生型模型：對雌激素（pink）與 R5020（blue）均展現出廣泛的轉錄應答。
Y537S 突變模型：主要的轉錄應答完全來自於黃體素（R5020）。
GSEA 通路分析：野生型模型對 R5020 的應答主要富集於 MAP 激酶瀑布信號（MAP kinase cascade）及細胞增殖相關通路；而 Y537S 突變模型對 R5020 的應答則轉向富集於細胞遷移（migration）與轉移（metastasis）相關通路。

2. Phospho-PR Ser294 ChIP-seq 分析

與 Chicago 大學 Geoffrey L. Greene 博士團隊（及研究生 Rosemary J. Huggins）合作，使用特定 phospho-PR Ser294 抗體進行全基因組結合分析：

基線與誘導：在未給藥（vehicle）條件下，野生型與 Y537S 突變株即展現出不同的 phospho-PR 結合峰；給予 R5020 刺激後，兩者均出現大量的結合峰獲得（major gain）。
位點差異：比較 R5020 誘發的 phospho-PR 結合位點發現，Y537S 突變模型除了包含野生型共有位點外，獲得了額外且獨特的 phospho-PR 結合位點（gain in binding sites）。
轉錄因子 Motif：Motif 分析顯示 Y537S 突變株的 phospho-PR 結合位點顯著富集了與 CSC 通路密切相關的轉錄因子，例如 SOX 與 SOX10。

3. 3D 腫瘤球 RNA-seq 與通路發現

由於 PR 敲降在 3D 腫瘤球實驗中展現出比抗黃體素藥物更明顯的抑制效果，團隊對 3D 培養下的 T47D（shGFP vs shPR）進行 RNA-seq：

PCA 分析：Y537S 突變是驅動整體基因表現量變異的最大因子。
PR 依賴性：Y537S 突變所誘導的 ER 標的基因表現高度依賴 PR；當敲降 PR 後，Y537S 誘導的基因表現量被重新拉回至接近野生型基線水平。
3D 通路改變：在 3D 腫瘤球條件下，Y537S 突變模型的分析顯示未折疊蛋白反應（unfolded protein response, UPR）、unfolded protein binding 與缺氧（hypoxia）等壓力相關路徑呈正向富集；這是轉錄體與路徑分析結果，不等同於每一分支皆已完成功能驗證。

未折疊蛋白反應（UPR）的作用與 UPR 超活化劑 ErSO 的療效

未折疊蛋白反應（UPR）是一種內質網應激（endoplasmic reticulum stress）反應，負責調控蛋白質穩態（protein homeostasis），並與內分泌抗藥性相關。UPR 由三條主要信號分支介導：ATF6、IRE1 與 PERK，可影響蛋白質折疊、細胞凋亡（apoptosis）與脂質生成（lipogenesis）。講者引用 David J. Shapiro 團隊的研究，說明 ESR1 突變會改變 UPR 的調控狀態。

1. UPR 表現與 shPR 敲降

針對 UPR 通路關鍵組分的熱圖分析顯示：

多數 UPR 組分在 Y537S 突變模型中顯著上調（upregulated）。
敲降 PR 能夠有效翻轉此現象，顯著降低 UPR 組分的表現量。

2. UPR 單一分支抑製劑 vs. UPR 超活化劑 ErSO

團隊測試了針對 UPR 三條信號分支的商業化小分子抑製劑，發現單獨抑制任一分支在野生型或 Y537S 突變模型中的腫瘤球抑制效果均相當溫和（modest）。講者解釋：適度的 UPR 活化對乳癌細胞具備保護作用（cytoprotective），能協助細胞處理龐大的蛋白質折疊需求。

為突破此局限，團隊採用了由 David J. Shapiro 博士團隊開發的小分子 UPR 超活化劑 ErSO：

作用機制：ErSO 能將 UPR 從「細胞保護性（cytoprotective）」轉向「細胞毒性（cytotoxic）」，誘發腫瘤細胞死亡。
實驗結果：在 3D 腫瘤球實驗中，ErSO 極為強效地抑制了野生型與 Y537S 突變模型的腫瘤球形成能力。
對 phospho-PR 的影響：ErSO 處置同時顯著降低了對 R5020 刺激所引發的 phosphorylated PR（Ser294）受體濃度。
研究啟示：在這些細胞與 3D 腫瘤球模型中，抑制 UPR 單一分支效果有限；UPR 超活化則同時影響 CSC 表型與 R5020 誘導的 phospho-PR。這是值得進一步驗證的臨床前治療方向，尚不能推論人體療效或安全性。

目前最可行的解讀是：PR／UPR 軸提供了可追蹤的臨床前機制與候選標的，但尚不足以支持在病人身上直接採用 antiprogestin 或 ErSO 的治療決策。

總結與研究展望

黃體素反應性：儘管 ESR1 突變體具備非依賴雌激素的特性，但其透過受體交互作用、轉錄組及全基因組結合（ChIP-seq），對黃體素（progesterone）處置仍保持高度反應性。
幹細胞與轉移調控：敲降 PR 可顯著抑制 ESR1 突變株的癌症幹細胞（CSC）族群擴增及循環腫瘤細胞（CTC）轉移殖落形成能力。
UPR 通路機制：3D 腫瘤球轉錄組把 UPR 指向一條 PR 依賴、可供後續驗證的 CSC 相關路徑；ErSO 在講者展示的臨床前模型中效果強，但仍是研究工具與候選策略，而非已確立的臨床治療。

現場問答

Q1：在臨床前模型與患者腫瘤中，雌激素誘導 PR 表現的「鐵律」是否存在例外？

提問者（University of Illinois）：演講中提及 PR 是雌激素反應基因。但現在有了越來越多的 PDX 與 PDO 模型，這個「雌激素必然上調 PR 表現」的規律有多堅固？是否存在雌激素無法上調 PR 的例外情況？
講者（Thu H. Truong, PhD）：是的，確實存在例外。在 Carol Sartorius 博士實驗室建立的 ER 陽性 PDX 模型中，有一個未接受過治療（treatment-naive）的 ER 陽性 PDX 模型，在其體內完全檢測不到 PR 表現。這是講者目前能立即舉出的例外範例，顯示在真實腫瘤模型中，雌激素對 PR 的誘導反應並非 100% 絕對。

Q2：在 ER 突變模型中打擊 PR，如何區分究竟是 PR 本身的功能，還是因為破壞了 ER 的輔因子功能？

提問者（University of Colorado）：當考慮在 ER 突變模型中標的 PR 時，如何區分標的 PR 的效果是來自於 PR 本身，還是因為 PR 是 ER 必需的共因子（cofactor）因而干擾了 ER 的功能？如果抑制 PR 等同於間接抑制了 ER，要如何單獨將功能歸因於 PR？
講者（Thu H. Truong, PhD）：講者對此問題亦思考許久。雖然 ESR1 突變體具備「非依賴雌激素（estrogen-independent）」的特性，但這並不代表它不依賴 ER（ER-independent）。目前講者實驗室的研究生 Jill 正透過更詳細的分子實驗來剖析此問題，重點研究在突變細胞中 PR 究竟與哪些蛋白因子結合（binding partners），以釐清兩者各自的獨立功能與相互依賴關係，目前尚待進一步研究確定（to be determined）。

Q3：UPR 超活化劑 ErSO 處理後，PR 磷酸化的改變細節為何？其他位點或後轉譯修飾情況如何？

提問者（University of Virginia）：在最後的實驗中，ErSO 處理對 PR 磷酸化產生了非常顯著的抑制效果。請問檢測的是哪一個磷酸化位點？是否有觀察其他磷酸化位點或其他轉譯後修飾（如 SUMO 化）的變化？
講者（Thu H. Truong, PhD）：在 ErSO 實驗中展示的磷酸化位點是 Ser294（Ser294 site）。對於其他 MAPK 磷酸化位點（例如 Ser345），講者團隊觀察到了完全相同的抑制趨勢。至於由其他蛋白激酶催化的磷酸化位點，或是 SUMO 化（SUMOylation）等其他轉譯後修飾，目前團隊尚未進行檢測，未來可由 Carol Lange 實驗室或其他團隊進一步深入探討。